一种3d细胞培养材料及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于材料化学与生物医药技术领域，具体涉及细胞体外三维培养的材料及其应生。
【背景技术】
[0002]三维细胞培养技术(three-dimens1nalcell culture, TDCC )是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迀移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。
[0003]三维细胞培养技术有着重要的应用。普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行，但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化，难以研宄单一过程，且难以研宄中间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。
[0004]肿瘤生物学:肿瘤的实验性治疗、肿瘤的侵袭性、转移和中心坏死的机制、肿瘤的血管形成和营养供给、体内基因表达、测试药物对肿瘤生长和向邻近组织转移的抑制效果的模拟等方面。
[0005]软骨和骨组织:成熟的软骨细胞和干细胞被广泛用于三维细胞培养，以再生损伤的软骨、骨、韧带、肌腱和膝关节半月板。
[0006]循环系统和心脏:在成熟的组织中及时产生血管网络是组织工程的重要课题；在治疗领域，所关心的也是如何有目的地改变血管形成，以抑制肿瘤的进展。
[0007]神经系统:培植单一神经元成为多细胞聚集体、海马体活标本切片后测试神经元电势、神经干细胞培养治疗老年痴呆症、帕金森病等。
[0008]可见细胞培养对生物医疗领域具有重大的意义。
[0009]目前，三维细胞培养的生物反应器研制进展迅速，而且种类多样，各有不同特点，都是以不同的方式提供给细胞最适宜的生长环境，目前较有代表性的有搅拌式、中空纤维、旋转等各种生物反应器。但到目前为止，针对肿瘤细胞，干细胞分化的抑制和培养具有良好的效果。但是针对不同的原代哺乳动物细胞，具体的微环境大小，细胞因子组合，以及微环境PH调节等等，特异性细胞的生长条件需要进一步设计具体产品。仍然没有一种细胞支架能完全同时满足多种细胞快速、高活力生长，且能满足干细胞有增殖过程中有效维持细胞干性的需要。
[0010]有鉴于此，有必要对现有三维细胞培养材料进行了改进，以解决上述问题。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供一种三维细胞培养材料。
[0012]本发明的另一目的在于提供上述三维细胞培养材料的应用。
[0013]本发明所采取的技术方案是: 一种三维细胞培养材料，所述三维细胞培养材料包括PEG8000@ Fe3O4和PEG4000Fe3O4; 二者的制备方法如下，
PEG8000i Fe3O4的制备方法:
1)烷基化:取粒径为15~25nm的Fe3O4纳米球，加入有机物的氨水溶液，混匀，于8°C ~10°C条件下反应16?20h，使Fe3O4纳米球表面被阳离子烷基化形成保护膜；
2)将烷基化的Fe3O4纳米球与磷酸化PEG8000水溶液混合，并通过氩气排除氧气，再加入金属盐，混匀在55?65°C条件下搅拌催化反应I?2h，即得PEG80000 Fe3O4;
PEG400i Fe3O4的制备方法与上述PEG80000 Fe3O4的制备方法相同，除了将磷酸化PEG8000改用为磷酸化PEG400，其他均不变。
[0014]进一步的，上述三维细胞培养材料还包括纳米粒NH2OFe3O4,其制备方法为:
O烷基化:取粒径为100~200nm的Fe3O4纳米球，加入有机物的氨水溶液，混匀，于8°C ~10°C条件下反应16?20h，使Fe3O4纳米球表面被阳离子烷基化形成保护膜；
2)氨基化:取上述烷基化后的Fe3O4纳米球加入到含氢氧化钠的氨水溶液中，混匀，使反应完全，即得氨基化的纳米粒NH2OFe3O4;
或者将烷基化后的Fe3O4纳米球加入纯正硅酸乙酯中，于14?18°C磁力搅拌18?22h对纳米粒进行包埋，洗脱包埋后的纳米颗粒，置于含氢氧化钠的氨水中反应完全，即得氨基化的纳米粒NH2OFe3O40
[0015]进一步的，上述有机物的氨水溶液中有机物的浓度为180?220g/L ;所述有机物为顺式十八碳-9-烯酸。
[0016]进一步的，上述步骤2)中烷基化的Fe3O4纳米球与磷酸化PEG8000水溶液的质量体积比为10g: (350-450)mL ;所述磷酸化PEG8000水溶液中PEG8000浓度为0.2-0.3g/mL。
[0017]进一步的，上述步骤2)中所述金属盐为CoCl2，金属盐加入量为使其终浓度为0.18—0.22mol/Lo
[0018]进一步的，上述所制得的PEG80000 Fe3O4、PEG400@ Fe3O4分别经红外线灭菌后，再用稀盐酸清洗，洗后分别保存在PBS缓冲液中，备用。
[0019]进一步的，上述步骤2)中所述含氢氧化钠的氨水溶液中的氢氧化钠浓度为1.8?2.2%w/v0
[0020]三维细胞培养材料的应用，应用过程中的具体操作包括以下步骤:
1)取权利要求1中所述的PEG8000@Fe304、PEG400@Fe3O4溶解到细胞培养基中，
2)将步骤I)中的培养基经超声波处理3~5min制备细胞培养空腔；
3 )将需要培养的细胞加入到上述经超声波处理后的培养基中，混匀，在常规培养条下进行培养即可。
[0021]进一步的，上述步骤I)中所述PEG8000@Fe304、PEG4000 Fe3O4、细胞培养基的用量比为(22?27) mg:(8?12) mg:(15?30) mL。
[0022]进一步的，在上述步骤I)的操作过程中，根据所培养的细胞的需求，可以将培养过程中需加入的细胞因子先与权利要求2所述的纳米粒NH2OFe3O4进行反应，制得纳米粒状的细胞因子OFe3O4,再将细胞因子OFe3O4与PEG8000@Fe 304、PEG4000 Fe3O4—起加入到细胞培养基中；
上述细胞因子OFe3O4的具体制备过程为:将权利要求2所述纳米粒NH2OFe3O4和细胞因子加入甲醛溶液或者戊二醛溶液中，混匀，反应完全即可。
[0023]本发明的有益效果是:
I)控制细胞微环境的变化是模拟细胞活体离体培养、抑制细胞分化、保持细胞活性大规模培养的关键技术。本发明三维细胞培养材料对肿瘤细胞、干细胞分化的抑制和培养具有良好的效果；且可满足对不同的原代哺乳动物细胞的培养。
[0024]2)本发明三维细胞培养材料可长时间保持微环境pH和细胞因子活性和浓度，更有利于细胞的快速生长、增殖以及细胞活的维持。在本发明中，三维细胞培养材料中纳米粒NH2OFe3O4方便、容易的固定细胞因子，束胶的外残基能以氢键在低浓度戊二醛的条件下结合细胞因子蛋白。防止了蛋白在水基中游离产生培养效率的低下。
[0025]3)在本发明中，PEG束胶的羟基端结合纳米Fe磁珠，在培养好的细胞进行下一步的细胞治疗或者其他分子生物学实验，传统的分离胶原和细胞的方法，无比复杂并且极端伤害细胞。本专利通过磁珠联合束胶，在磁场的作用下，没有磁性的细胞会游离到水基中。
[0026]4)本发明的3D细胞培养束胶构造的羟基端带上纳米磁珠。便于细胞脱胶，将培养好的细胞完好地的释放到水基中。
[0027]5)肿瘤细胞可以通过自分泌和旁分泌，改变和维持自身生存和发展的条件，促进肿瘤的生长和发展。干细胞龛(the stem cell niche)是干细胞的集中存储部位，通过特定的细胞外基质和龛细胞提供特殊的微环境，对维持干细胞的高增殖力和诱导定向分化起关键作用。原代细胞在活体特定部位也有其特定的培养条件。本发明3D培养材料采用PEG为基本结构，惰性强，pH值稳定，在形成的三维微环境中可以保持肿瘤所需要的生长因子作用活性；保持三维微环境中保持干细胞干性的细胞因子。也能长时间地维持模拟原代细胞生长的微环境。
[0028]6)细胞三维培养时，需要把三维材料的微环境打开，让细胞释放到水基中，这是传统三维培养比较困难的部分，而本发明3D培养材料在束胶上带上Fe性磁珠，结合磁力架的使用，该材料的构象会发生改变，细胞很容易融解到水基中。
【附图说明】
[0029]图1为含有本发明材料的细胞培养基的稳定性检测；
图2为本发明3D细胞培养材料形成微环境的电镜图。
【具体实施方式】
[0030]一种三维细胞培养材料，所述三维细胞培养材料包括PEG8000@ Fe3O4和PEG4000Fe3O4; 二者的制备方法如下，
PEG8000i Fe3O4的制备方法:
1)烷基化:取粒径为15~25nm的Fe3O4纳米球，加入有机物的氨水溶液，混匀，于8°C ~10°C条件下反应16?20h，使Fe3O4纳米球表面被阳离子烷基化形成保护膜；
2)将烷基化的Fe3O4纳米球与磷酸化PEG8000水溶液混合，并通过氩气排除氧气，再加入金属盐，混匀在55?65°C条件下搅拌催化反应I?2h，即得PEG80000 Fe3O4;
PEG400i Fe3O4的制备方法与