水稻高抗白叶枯病基因特异性标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及I个高效抗水稻白叶枯病的基因的DNA标记及其在育种中的应用，属于分子遗传育种领域。
【背景技术】
[0002]水稻白叶枯病是由革兰氏阴性黄单孢菌水稻变种(Xanthomonas oryzaepv.0ryzae, Xo0.)所引起的一种世界性细菌病害，它与稻瘟病、纹枯病一起被称为水稻的“三大病害”。水稻遭遇白叶枯病后，一般减产20?30%，严重时可达50%，甚至绝收。发掘和利用抗病基因是防治水稻白叶枯病的最有效方法。迄今，国际上在水稻中已鉴定了近40个抗白叶枯病基因(国家水稻数据中心http://www.ricedata.cn)，但是只有少数几个兼具全生育期、广谱、持久等良好的抗病特性，真正能有效地用于水稻抗白叶枯病的育种和生产的基因并不多。目前，育种家们通过分子标记辅助选择(molecular assistedselectoin，MAS)，已利用Xa4、Xa21和Xa23选育出了许多抗病恢复系品种，如IR26、IR28、IR30、IR32、IR36、IR50、IR54等。国内大面积种植的杂交稻中大多含有Xa4基因，不过长期大面积地使用单一抗源已经导致了新致病菌株的进化，杂交稻抗病的持久性得不到保证。因此，如何利用新的抗病基因，尽快提高杂交稻的抗病性是育种中急待解决的问题。
[0003]水稻Xa7基因是一个高抗、广谱、持久的抗白叶枯病基因，对多个菲律宾生理小种都具有全生育期的抗性，是水稻抗病育种中一个较为理想的抗源。Xa7基因源于孟加拉稻种DV85和DV86，国际水稻所将DV85与IR24回交，构建了含Xa7的近等基因系IRBB7 ;我国一个强优恢复系水稻品种“镇恢084”以91-2156为母本，与由DV85选育的抗病品系R19杂交而成，该品种也带有Xa7基因。因此，利用MAS等现代育种技术，将Xa7基因导入主栽的杂交稻恢复系中，有望大大提高我国水稻的抗病性和生产安全。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供水稻高抗白叶枯病基因特异性标记及其应用，本发明能用于Xa7基因的精准的鉴定及其在水稻育种中应用。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻高抗白叶枯病基因特异性标记(即，水稻抗白叶枯病基因Xa7特异性的DNA标记)，该标记为Xa7GSM ;其对应的核苷酸序列为SEQ ID N0:1(来自水稻品种——IRBB7)。
[0006]作为本发明的水稻高抗白叶枯病基因特异性标记的改进:基于PCR技术时，PCR扩展引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5' —3';
[0007]Xa7GSM:
[0008]正向引物5 ’ CCTGCTCGAGCTAATCCAAATC 3 ’，
[0009]反向引物5 ’ GATACTGTCATTCTTCACGGTCTG 3 ’。
[0010]本发明还提供了上述水稻高抗白叶枯病基因特异性标记的用途:用于水稻Xa7基因的辅助选择育种，或者用于克隆Xa7基因。
[0011]由于Xa7基因还没有被克隆，没有办法设计基因功能标记。发明人利用“图位克隆”技术对Xa7基因进行了精细定位，并构建了水稻IRBB7(含Xa7)和IR24(不含Xa7的等基因系)的基因组文库，通过测序和序列比对开发了一个与Xa7基因紧密连锁的特异性分子标记，在Xa7遗传育种中可以比较快速、精确的鉴定Xa7基因，大大提高基因转育的效率。
[0012]发明人在发明过程中，
[0013]首先，在已将Xa7基因定位于水稻第6染色体的50kb间基础上，分别构建了水稻抗病品种IRBB7(含Xa7)与其近等基因系感病品种IR24(不含Xa7)的基因组文库，利用Xa7基因定位区间的分子标记，筛选到了覆盖定位区间序列的跨叠BAC克隆，并对这些BAC克隆进行了高通量测序。通过比对IRBB7和IR24中Xa7基因定位区间的序列，在IRBB7中发现了一些差异序列，在IR24中相应基因组位置则没有存在。将这些序列在国际权威的生物学NCBI数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)进行比对，在现有的水稻DNA数据中没有搜索到相同或相似的序列，表明在IRBB7中这些序列是新发现的水稻基因组序列。
[0014]然后，由于以上序列在Xa7基因的定位区间内，与Xa7基因紧密连锁，甚至有可能是Xa7基因序列的一部分。因此，本发明利用以上序列中的I个位点，开发了 I个新的DNA标记，用于精确的检测Xa7基因，并利用这个标记成功将Xa7基因转育到了浙江省主栽杂交稻的父本恢复系品种“密阳46”中，明显增强了这个品种对白叶枯病的抗性。
[0015]本发明的具体技术内容如下:根据以上在水稻IRBB7中发现的I个新DNA序列，分别设计PCR引物，开发出I个对应的DNA标记Xa7GSM。用这个标记的引物，对水稻IRBB7 (含Xa7)和IR24 (不含Xa7)的基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，在IRBB7的PCR产物中可分别检测到315bp (如SEQ ID NO:1所示)的条带，而IR24的PCR产物中检测不到无相应的条带(图1)。表明标记Xa7GSM与Xa7基因具有很高的一致性，能精确的分析待测水稻品种是否含有Xa7基因，在Xa7遗传育种中可以大大提高基因转育的效率。
[0016]利用本发明检测出某个水稻品种内是否含有“Xa7基因位点”的最终目的是:确认在被测定水稻品种中是否含有Xa7基因。目前由于还没有克隆Xa7基因，也没有报道用于鉴定Xa7基因的紧密连锁的分子标记。一般现在可采用白叶枯病菌的抗谱分析来鉴定Xa7基因的存在，但是该方法需要多个菲律宾生理小种，接菌条件包括水稻的生育时期、气候、温度等也比较严格，不适合大面积的鉴定和应用。
[0017]本发明具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，而且该标记的稳定性好，不受其它基因效应和环境因素的影响，可在早代选择，缩短育种年限，提高育种效率，适于推广应用。本发明对水稻抗白叶枯的品种改良具有重要意义，用于Xa7基因的辅助选择育种，同时为克隆Xa7基因奠定了良好的基础。
【附图说明】
[0018]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0019]图1为IRBB7和IR24的Xa7GSM标记分析图；
[0020]图1 中！Marker，DL2000 (TaKaRa 公司);Xa7GSM，为本发明开发的 Xa7 基因 DNA 标记；RM20591，国际水稻研宄所开发的公认分子标记，且位于Xa7基因定位区间内，该标记的序列在IRBB7和IR24都存在，在此作为实验对照。
[0021]图2为各种含Xa7和不含Xa7水稻品种的Xa7GSM标记检测图；
[0022]图2中！Marker，DL2000 (TaKaRa公司);含Xa7基因的水稻品种:IRBB7 (对照)、DV85、DV86、和镇恢084 ;不含Xa7基因的水稻品种:日本晴、中花11、TP309、9311、浙辐802、成恢448、沈农1033。
[0023]图3转育Xa7基因的密阳46的Xa7GSM标记检测图；
[0024]图3 中:Marker，DL2000 (TaKaRa 公司);IRBB7，对照；密阳 46，不含 Xa7 的密阳 46 ；密阳46(Xa7)，转育Xa7基因的密阳46。
[0025]图4转育Xa7基因的密阳46的白叶枯病抗性鉴定图；