斑马鱼tmem132e基因的cDNA全长序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及斑马鱼tmeml32e基因全长表达序列和 所编码的一种蛋白，以及该基因的克隆和检测方法。
【背景技术】
[0002] 大多数生命过程在长期的进化过程中具有高度的保守性，模式生物也因此成为研 宄人类发育、系统功能、疾病发生等的重要工具，特别是脊椎动物和人类的胚胎发育过程在 形态上相当类似，在细胞和分子水平上所涉及的信号通路和基因一般也有高度的同源性。 斑马鱼作为一种新型的脊椎模式生物，具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成 熟周期短、个体小易养殖等诸多优点，特别是可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选。 这些特点使其成为功能基因组时代生命科学研宄中重要的模型生物之一，已经被广泛应用 于人类疾病和胚胎发育过程的研宄。
[0003] 位于人类 17ql2 的TMEM132E(transmembraneprotein132E)基因包括 10 个外显 子，基因组长约60kb，cDNA全长2955nt，编码985个氨基酸的单跨膜型糖蛋白，该基因的突 变会导致人常染色体隐性遗传非综合症耳聋（DFNB99)，但具体机制尚不明确，软件分析未 发现类似相关蛋白。我们拟借助斑马鱼这一模式生物，利用斑马鱼作为模式生物的优点， 通过研宄斑马鱼中人TMEM132E的同源基因tmeml32e的功能，为阐明人TMEM132E该基因的 生物学功能奠定基础。
[0004] 分析发现，在NCBIGenbank中已经有两个斑马鱼tmeml32e的mRNA序列，分别 为XM_003198707 和XM_68740,都是在 2011 年 3 月被提交至Genbank。其中XM_003198707 序列为tmeml32e基因的部分mRNA序列，只有1451bp;XM_68740全长为2615bp，这两个序 列都是在斑马鱼基因组测序结果的基础上，通过计算机软件分析预测出的斑马鱼tmeml32e 基因的mRNA序列，并没有在实验室中被验证。因此，得到斑马鱼tmeml32e基因正确的全长 cDNA序列和所编码的蛋白，是研宄斑马鱼tmeml32e基因功能的首要任务和目前亟待解决 的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种斑马鱼tmeml32e基因，已注册于NCBIGenbank，命名为 JX995104。斑马鱼tmeml32e基因的cDNA全长为3222bp，包含3219bp的开放阅读框，其核 苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0006] 本发明提供了上述基因编码翻译出的蛋白质分子，具有1073个氨基酸残基，其氨 基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0007] MGHFVVQGDLPWILCSLRLVIMIIAGKVSPTSSDALFSVPVPSA
[0008] TSSPPEVYLPATFKLSNTQLAFFLQENRAPSYGSQRGHPLQRSESFVVFQTKELPAVN
[0009] ISLGPFTQDQTLSKDLLQPSSPLDIPGRLTVNWKVRAFIVQSRVYASNPLVQVLFYIA
[0010] GRDWDDFKIQDKLPCVRLHAFRDVREIKTSCRLQGNLAQCLAQLDLPSTWFNVNVAPL
[0011] GRRKSSGTDGLELTGETLQVELYYTLHDPDSNDECGESYPRRGGPSRGESLSQQPLLR
[0012] IGSISLYQPSQEQLVVDKQLDKNLFLRLPERPLKPGETLNIYLLLVPNSTVEQFTLKV
[0013] KAKKGVNLLSTKSRSNQWRVEWDMQSGAKHSIATVEASKIKGVSGDMAGSIEIMQLDF
[0014] EMENFTSQSVTRRINWNIDYRGQNPTSDAEKVVTELTVVQKDIQAIIPLSMDTEIINT
[0015] AVLTGRTVAIPVKVVSIELNGAVTDVSSSVQCKSFNEDIVKVSMNCDYVFVNGKETRG
[0016] SMNARVIFSYEHLSAPLELTVWVPKLPLKVELSDNRLSFIKGWRVPILPDRRTARDSD
[0017] DDDDDDRKVSRGCTLQYQRAQIKVLTQFHTTSSEGTNQMITMLGPDWQVDVTELVQDS
[0018] LKVVDGRVAELADRTVLVANELGSSTLKVESPLAVEAVLGETQFSVVDEKVSIVELRV
[0019] HAISGLALNLQPSPGNSHTMVAKATGLQTLSTLKQEASFSIWVYYSDNTAAPLSMYDP
[0020] KDYNLNGTSADDKVVTVAQQPQQRWPVIIAEGEGTCDIVHVEMTISETCQKTKRKSVI
[0021] ASSSVFVKVRFGTDEDSEEDMEMETEIDTRMPANTRRPAIDSNVGGAGYEPSNEQPAS
[0022] VPIDYTNFPTISNPEEPTEEDEEDDEFVHSPRSMTDLEIGMYALLGVFCLAILVFLIN
[0023] CIVFVLKYRHKRIPPEGQANMDHSHHWVFLGNGEPLRTQSDLSPQTVESPSNTLEGVQ
[0024] TCCHGDHHSSGSSQTSVQSQVHGRGDGSSGGSTKDHGEDASSPTSKRKRVKFTTFTLP
[0025] TEDLPYNSIPIANEEDIQWVCQDMGFQDQEELHDYMRRIKEIA。
[0026] 本发明还提供了用于扩增斑马鱼tmeml32e基因的引物序列，其中，用于扩增斑马 鱼tmeml32e基因5'端的引物序列如SEQIDN0. 3和SEQIDN0. 4所示，扩增出的片段长 度为1042bp;用于扩增斑马鱼tmeml32e基因3'端的引物序列如SEQIDNO. 5和SEQID NO. 6所示，扩增出的片段长度为2280bp。
[0027] SEQIDNO. 3 ：5'ATGGGACATTTTGTTGTTCAAG3,
[0028] SEQIDNO. 4 :5'TTGACTTGGTGCTGAGGAGATT3'
[0029] SEQIDNO. 5 :5'GACCCTCAACATCTATCTGCTC3'
[0030] SEQIDNO. 6 :5'GGCTATTTCCTTTATCCTGCGC3'
[0031] 本发明进一步提供了斑马鱼tmeml32e基因序列的克隆方法，包括以下步骤：
[0032] (1)提取斑马鱼幼体总RNA;
[0033] 取受精后3天的Tu系野生型斑马鱼，在1. 5ml的Ep管中用研磨棒粉碎，然后用 Takara公司的Trizol试剂盒，按照试剂盒说明书操作提取出总RNA.
[0034] ⑵引物设计
[0035] 首先从NCBIGenbank中下载斑马鱼tmeml32e的mRNA序列，分别为XM_003198707 和XM_68740,经过BLAST比对，分析二者的共有序列，使用Primer5软件设计引物。由于 该基因较大，所以设计两对引物分别扩增斑马鱼tmeml32e基因cDNA的5'端和3'端，为 便于拼接全长，设计的引物要保证扩增的两DNA片段有部分序列重叠。用于扩增斑马鱼 tmeml32e基因5'端的引物序列如序列表中SEQIDN0. 3和SEQIDN0. 4所示；用于扩增 斑马鱼tmeml32e基因3'端的引物序列如序列表中SEQIDN0. 5和SEQIDN0. 6所示。
[0036] (3)cDNA合成
[0037] 以提取的斑马鱼幼体总RNA为模板，使用Fermentas公司的Reverse Transcription试剂盒，以Oligo(dT) 18为引物，按照试剂盒说明书反转录合成cDNA。
[0038] (4)PCR扩增
[0039] 用上述反转录产物做模板，PCR扩增tmeml32e的5'端和3'端，PCR反应中的DNA 聚合酶为Takara公司的LA Taq DNA聚合酶。PCR体系见下表：
【主权项】
1. 一种斑马鱼tmeml32e基因，其特征在于，DNA全长为3222bp，包含3219bp的开放阅 读框，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
2. -种由权利要求1所述的斑马鱼tmeml32e基因所编码的蛋白质分子，其特征在于， 具有1073个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
3. -种用于获取权利要求1所述的斑马鱼tmeml32e基因的引物序列，其特征在于，包 括用于扩增该斑马鱼tmeml32e基因5'端的引物序列和扩增该斑马鱼tmeml32e基因3'端 的引物序列。
4. 如权利要求3所述的用于获取权利要求1所述的斑马鱼tmeml32e基因的引物序列， 其特征在于，所述用于扩增该斑马鱼tmeml32e基因5'端的引物序列如SEQIDNO. 3和SEQ ID勵.4所示，扩增出的片段长度为1042匕？。
5. 如权利要求3所述的用于获取权利要求1所述的斑马鱼tmeml32e基因的引物序列， 其特征在于，所述用于扩增该斑马鱼tmeml32e基因3'端的引物序列如SEQIDNO. 5和SEQ ID勵.6所示，扩增出的片段长度为228(^?。
6. 权利要求1所述的斑马鱼tmeml32e基因序列的克隆方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 提取斑马鱼幼体总RNA; (2) 引物设计：分别设计用于扩增斑马鱼tmeml32e基因cDNA的5'端和3'端的引物， 其中，用于扩增斑马鱼tmeml32e基因5'端的引物序列如序列表中SEQIDNO. 3和SEQID NO. 4所示；用于扩增斑马鱼tmeml32e基因3'端的引物序列如序列表中SEQIDNO. 5和SEQ IDNO. 6 所示； (3) cDNA合成：以步骤（1)提取的斑马鱼幼体总RNA为模板，以Oligo(dT) 18为引物， 反转录合成cDNA; (4)PCR扩增：用步骤（3)的反转录产物做模板，PCR扩增tmeml32e的5'端和3'端， PCR反应中的DNA聚合酶为LATaqDNA聚合酶； (5)PCR产物纯化回收：取步骤（4)所得扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增目的 条带从琼脂糖中取出，回收胶中的PCR产物； (6) 克隆测序：将步骤（5)回收的DNA片段克隆至pMDIS-T载体，进行转化和菌落克隆 的挑选，利用步骤（4)的PCR扩增体系对菌落进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产 物大小同预期，则为阳性克隆，进行测序，测序结果与XM_003198707和XM_68740两克隆经 过BLAST比对拼接，得到斑马鱼tmeml32ecDNA序列。
7. 如权利要求6所述的斑马鱼tmeml32e基因序列的克隆方法，其特征在于，步骤（4) 中，PCR扩增条件为：94°C4min;94°C50s;58°C40s;72°C2min，35cycles;72°ClOmin。
8. 权利要求I所述的斑马鱼tmeml32e基因在制备玛琳代寡核苷酸中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种斑马鱼tmem132e基因的cDNA全长序列及其应用。本发明提供了斑马鱼tmem132e基因的全长序列，其DNA全长为3222bp，包含3219bp的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。提供了由该斑马鱼tmem132e基因编码的蛋白质分子。通过本发明的斑马鱼tmem132e基因，可以根据基因序列人工合成或转基因生物合成具有生物活性的纯化蛋白或寡核苷酸，有助于了解斑马鱼tmem132e基因的基因组结构，分析该基因的表达和蛋白的功能。
【IPC分类】C07K14-46, C12N15-11, C12N15-12, C12N15-113, C12N15-10
【公开号】CN104818282
【申请号】CN201510108488
【发明人】李江夏, 刘奇迹, 龚瑶琴
【申请人】山东大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年3月12日