用于控制植物病毒感染的方法和组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2012年10月16日提交的美国临时专利申请号61/714, 733和2013 年3月14日提交的美国临时专利申请号61/786, 032的权益，这些专利以引用的方式整体 并入本文。
[0003] 序列表的合并
[0004] 包含在名称为"M0NS317W0sequencelisting. txt"的文件中的序列表如在 Microsoft Windows操作系统中所测量是251千字节且在2013年10月11日生成，所述序 列表与此一起以电子方式提交并且以引用的方式并入本文。
技术领域
[0005] 所述方法和组合物大体上涉及植物疾病控制领域。更具体地说，本发明涉及用于 治疗或预防与植物番茄斑萎病毒属或双生病毒组感染有关的症状的方法和组合物。
【背景技术】
[0006] 番茄斑萎病毒属和双生病毒组的植物病毒在经济学上是重要的，它们导致减少的 植物产量和感染植物的死亡。设法保护其作物不受番茄斑萎病毒属侵害的种植者在传统上 试图以杀虫剂施用或用反光膜或塑料盖防护其作物不受昆虫媒介的危害。因为这些策略取 得了有限的成功，并且是昂贵和劳动密集型的，所以需要用于控制番茄斑萎病毒属和双生 病毒组感染的替代性策略。
【发明内容】
[0007] 本文所述的实施方案涉及用于预防或治疗植物中的病毒感染的方法和组合物，其 包括向植物局部施用包含至少18个与病毒基因基本上相同或基本上互补的连续核苷酸的 多核苷酸。多核苷酸可以是单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)或双链 RNA (dsRNA) 〇
[0008] -方面，本发明提供一种治疗或预防植物中的番茄斑萎病毒属感染的方法，其包 括：向所述植物局部地施用包含反义单链DNA多核苷酸和转移剂的组合物，其中所述反义 单链DNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互 补，其中病毒感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所 述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一些实施方案中，反义单链DNA多核苷酸包含至 少18个与选自由SEQ ID NO: 13-46组成的组的序列基本上互补的连续核苷酸。在一个实 施方案中，转移剂是有机硅表面活性剂组合物或包含在其中的化合物。在另一实施方案中， 所述组合物包含超过一种反义单链DNA多核苷酸，所述反义单链DNA多核苷酸与必需的番 茄斑萎病毒属基因序列、所述必需的番茄斑萎病毒属基因序列的RNA转录物、或其片段的 全部或一部分互补。在另一实施方案中，反义单链DNA多核苷酸选自由SEQ NO: 1-12或其 片段组成的组。在另一实施方案中，所述番茄斑萎病毒属选自由以下组成的组：豆坏死花 叶病毒、辣椒萎黄病病毒、落花生芽坏死病毒、落花生环斑病毒、落花生黄斑病毒、风仙花坏 死斑病毒、鸢尾黄斑病毒、甜瓜黄斑病毒、花生芽坏死病毒、花生黄斑病毒、大豆叶脉坏死相 关病毒、番茄褪绿斑病毒、番茄坏死环斑病毒、番茄斑萎病毒、番茄带斑病毒、西瓜芽坏死病 毒、西瓜银色斑驳病毒以及绿皮密生西萌芦致命萎黄病病毒。在另一实施方案中，必需的 番茄斑萎病毒属基因选自由以下组成的组：核衣壳基因（N)、外壳蛋白基因（CP)、毒力因子 NSm和NSs、以及RNA依赖性RNA聚合酶L节段（RdRp/L节段）。在另一实施方案中，必需的 基因序列选自由SEQ ID NO: 13-46组成的组。在另一实施方案中，组合物通过喷雾、撒粉来 局部施用，或作为基质包裹的DNA施用于植物表面。
[0009] 另一方面，本发明提供一种包含反义单链DNA多核苷酸和转移剂的组合物，其中 所述反义单链DNA多核苷酸与必需的番前斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一 部分互补，其中所述组合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状 的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或 排除的。在一些实施方案中，必需的基因序列选自由SEQ ID NO: 13-46组成的组，或转移剂 是有机硅组合物，或反义单链DNA多核苷酸选自由SEQ ID NO: 1-12组成的组。
[0010] 另一方面，本发明提供一种减少必需的番茄斑萎病毒属基因表达的方法，其包括 将番茄斑萎病毒属颗粒与包含反义单链DNA多核苷酸和转移剂的组合物接触，其中所述反 义单链DNA多核苷酸与所述番茄斑萎病毒属中必需的基因序列或其RNA转录物的全部或一 部分互补，其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条 件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中，必需的基因 序列选自由SEQ ID NO: 13-46组成的组。在另一实施方案中，转移剂是有机硅化合物。在 另一实施方案中，反义单链DNA多核苷酸选自由SEQ ID NO: 1-12或其片段组成的组。
[0011] 另一方面，本发明提供一种鉴定当局部地治疗植物时适用于调节番茄斑萎病毒属 基因表达的反义单链DNA多核苷酸的方法，其包括：a)提供包含与必需的番茄斑萎病毒属 基因或其RNA转录物的全部或一部分互补的区域的多个反义单链DNA多核苷酸；b)用所述 反义单链DNA多核苷酸中的一个或多个和转移剂局部地治疗所述植物；c)分析所述植物或 提取物用于调节番茄斑萎病毒属感染的症状；以及d)选择能调节番茄斑萎病毒属感染的 症状或发生的反义单链DNA多核苷酸。在一个实施方案中，转移剂是有机硅化合物。
[0012] 另一方面，本发明提供一种包含反义单链DNA多核苷酸和农药的混合物的农业化 学组合物，其中所述反义单链DNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转 录物的全部或一部分互补，其中所述组合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒属感 染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗 的植物是减少或排除的。在一个实施方案中，农药选自由以下组成的组：抗病毒化合物、杀 虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学绝育剂、化学信息素、驱避剂、 弓丨诱剂、信息素、取食刺激剂以及生物杀虫剂。
[0013] 另一方面，本发明提供一种治疗或预防植物中的番茄斑萎病毒属感染的方法，其 包括：向所述植物局部地施用包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物，其中所述双链RNA 包含与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分基本上互补的多 核苷酸，其中病毒感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不 用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一些实施方案中，双链RNA包含与选自由SEQ ID NO: 13-46组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的多核苷 酸。在一个实施方案中，转移剂是有机硅表面活性剂组合物或包含在其中的化合物。在另 一实施方案中，所述组合物包含超过一种双链RNA，所述双链RNA包含与必需的番茄斑萎病 毒属基因序列、所述必需的番茄斑萎病毒属基因序列的RNA转录物、或其片段的全部或一 部分互补的多核苷酸。在另一实施方案中，双链RNA多核苷酸包含与如SEQ N0:47-103、 448-483中所列举的核苷酸序列或其片段基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在一些实 施方案中，dsRNA的反义多核苷酸包含悬突在3'端上的与靶基因互补的二（2)核苷酸。在 另一实施方案中，所述番茄斑萎病毒属选自由以下组成的组：豆坏死花叶病毒、辣椒萎黄病 病毒、落花生芽坏死病毒、落花生环斑病毒、落花生黄斑病毒、风仙花坏死斑病毒、鸢尾黄斑 病毒、甜瓜黄斑病毒、花生芽坏死病毒、花生黄斑病毒、大豆叶脉坏死相关病毒、番茄褪绿斑 病毒、番茄坏死环斑病毒、番茄斑萎病毒、番茄带斑病毒、西瓜芽坏死病毒、西瓜银色斑驳病 毒以及绿皮密生西萌芦致命萎黄病病毒。在另一实施方案中，必需的番茄斑萎病毒属基因 选自由以下组成的组：核衣壳基因（N)、外壳蛋白基因（CP)、毒力因子NSm和NSs、以及RNA 依赖性RNA聚合酶L节段（RdRp/L节段）。在另一实施方案中，必需的番茄斑萎病毒属基 因选自由SEQ ID NO: 13-46组成的组。在另一实施方案中，组合物通过喷雾、撒粉来局部施 用，或作为基质包裹的RNA施用于植物表面。
[0014] 另一方面，本发明提供一种包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物，其中所述 双链RNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互 补，其中所述组合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展 在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。 在一个实施方案中，必需的基因序列选自由SEQ ID NO: 13-46组成的组。在另一实施方案 中，转移剂是有机硅组合物。在另一实施方案中，双链RNA包含与选自由SEQ NO: 47-103和 448-483组成的组的核苷酸序列基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在一些实施方案中， dsRNA的反义多核苷酸包含悬突在3'端上的与靶基因互补的二（2)核苷酸。
[0015] 另一方面，本发明提供一种减少必需的番茄斑萎病毒属基因表达的方法，其包括： 将番茄斑萎病毒属颗粒与包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物接触，其中所述双链 RNA包含与所述番茄斑萎病毒属中必需的基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补的 多核苷酸，其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条 件下生长时不用所述组合物治疗的植物简而言之减少或排除的。在一个实施方案中，必需 的基因序列选自由SEQ ID NO: 13-46组成的组。在另一实施方案中，转移剂是有机硅化合 物。在另一实施方案中，双链RNA包含与选自由SEQ ID N0:47-103、448-483或其片段组成 的组的核苷酸序列基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在一些实施方案中，dsRNA的反 义多核苷酸包含悬突在3'端上的与靶基因互补的二（2)核苷酸。
[0016] 另一方面，本发明提供一种鉴定当局部地治疗植物时适用于调节番茄斑萎病毒属 基因表达的双链RNA多核苷酸的方法，其包括：a)提供包含与必需的番茄斑萎病毒属基因 或其RNA转录物的全部或一部分互补的区域的多个双链RNA多核苷酸；b)用所述双链RNA 多核苷酸中的一个或多个和转移剂局部地治疗所述植物；c)分析所述植物或提取物用于 调节番茄斑萎病毒属感染的症状；以及d)选择能调节番茄斑萎病毒属感染的症状或发生 的双链RNA多核苷酸。在一个实施方案中，转移剂是有机硅化合物。在一些实施方案中，双 链RNA包含与选自由SEQ ID NO: 13-46组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上相 同或基本上互补的多核苷酸。
[0017] 另一方面，本发明提供一种包含双链RNA多核苷酸和农药的混合物的农业化学组 合物，其中所述双链RNA包含与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或 一部分基本上互补的多核苷酸，其中所述组合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒 属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物 治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中，农药选自由以下组成的组：抗病毒化合 物、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀菌剂、杀蝴剂、生长调节剂、化学绝育剂、化学?目息素、驱 避剂、引诱剂、信息素、取食刺激剂以及生物杀虫剂。
[0018] 又一方面，本发明提供一种治疗或预防植物中的双生病毒组感染的方法，其包括： 向所述植物局部地施用包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物，其中所述双链RNA包含 与必需的双生病毒组基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补的多核苷酸，其中病毒 感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治 疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中，转移剂是有机硅表面活性剂组合物或包含 在其中的化合物。在另一实施方案中，组合物包含超过一种双链RNA，所述双链RNA包含 与必需的双生病毒组基因序列、所述必需的双生病毒组基因序列的RNA转录物、或其片段 的全部或一部分基本上互补的多核苷酸。在另一实施方案中，双链RNA包含与选自由SEQ NO: 104-268或其片段组成的组的序列的至少18个核苷酸基本上相同或基本上互补的多 核苷酸。在另一实施方案中，双生病毒组选自由以下组成的组：大麦黄矮病病毒、黄瓜花叶 病毒、茄瓜花叶病毒、棉花缩叶病毒、番茄黄色缩叶病毒、番茄金色花叶病毒、马铃薯黄化叶 病毒、胡椒缩叶病毒、S金色花叶病毒、S金色花叶病毒、番前斑驳病毒。又一方面，必需的 双生病毒组基因选自由以下组成的组：核衣壳基因（N)、外壳蛋白基因（CP)、毒力因子NSm 和NSs、以及RNA依赖性RNA聚合酶L节段（RdRp/L节段）、沉默抑制基因、移动蛋白（MP)、 附&、0?-队三基因块、0?-?3、1^-?4、02以及八02。在另一实施方案中，必需的基因序列选自 由SEQ ID N0:269-447组成的组。在另一实施方案中，组合物通过喷雾、撒粉来局部施用， 或作为基质包裹的RNA施用于植物表面。
[0019] 另一方面，本发明提供一种包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物，其中所述 双链RNA包含与必需的双生病毒组基因序列如由SEQ ID N0:104-268、269-447所列举的一 个或其RNA转录物的全部或一部分基本上互补的多核苷酸，其中所述组合物局部地施用于 植物并且其中双生病毒组感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下 生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中，必需的基因序列 选自由SEQ ID N0:269-447组成的组。在另一实施方案中，转移剂是有机硅组合物。在另 一实施方案中，双链RNA多核苷酸选自由SEQ NO: 104-268组成的组。
[0020] 另一方面，本发明提供一种减少必需的双生病毒组基因表达的方法，其包括：将双 生病毒组颗粒与包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物接触，其中所述双链RNA包含与 所述双生病毒组中必需的基因序列或其RNA转录物的全部或一部分基本上互补的多核苷 酸，其中双生病毒组感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时 不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中，必需的基因序列选自由 SEQ ID N0:269-447组成的组。在另一实施方案中，转移剂是有机硅化合物。在另一实施方 案中，双链RNA包含与选自由SEQ NO: 104-268或其片段组成的组的序列的至少18个核苷 酸基本上相同或基本上互补的多核苷酸。
[0021] 又一方面，本发明提供一种鉴定当局部地治疗植物时适用于调节双生病毒组基因 表达的双链RNA多核苷酸的方法，其包括：a)提供包含与必需的双生病毒组基因或其RNA 转录物的全部或一部分互补的区域的多个双链RNA多核苷酸；b)用所述双链RNA多核苷酸 中的一个或多个和转移剂局部地治疗所述植物；c)分析所述植物或提取物用于调节双生 病毒组感染的症状；以及d)选择能调节双生病毒组感染的症状或发生的双链RNA多核苷 酸。在一个实施方案中，转移剂是有机硅化合物。在一些实施方案中，双链RNA包含与选 自由SEQ ID N0:269-447组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上相同或基本上互 补的多核苷酸。在一些实施方案中，双生病毒组是黄瓜花叶病毒并且双链RNA包含与选自 由SEQ ID N0:269-316组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上相同或基本上互补 的多核苷酸。在一些实施方案中，双生病毒组是茄瓜花叶病毒并且双链RNA包含与选自由 SEQ I