一条c螺旋区突变的瘦素活性肽及其编码基因和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体设及一条C螺旋区突变的瘦素活性 肤及其编码基因和应用。
【背景技术】：
[0002] 肥胖是人类健康最大的敌人之一，既是一个独立的疾病，又是II型糖尿病、屯、血管 病、高血压、脑中风和多种癌症的致病诱因，被世界卫生组织列为导致疾病负担的十大威胁 之一，是不容忽视的全球性的问题。据报道，全世界每年约有1800万人死于由糖尿病和高 血压引发的屯、脑血管疾病，而肥胖是糖尿病和高血压的关键致病因素。肥胖症严重危害了 人类的健康，给社会造成巨大的损失。据报道2003年，我国因为肥胖、糖尿病等慢性疾病的 支出就达到1. 2万亿元，占GDP的10. 3%。增长速度已经高于国民生产总值的增长速度。 目前国内减肥市场需求十分广阔，2010年减肥品消费额达600亿元，而与肥胖症有直接或 间接关系的疾病如糖尿病、屯、血管疾病等所造成的损失更是无法估计。目前用于肥胖症和 糖尿病治疗的药物-非诺贝特和罗格列酬，虽然能够起到降低血脂和血糖的作用，但是长 期服用会对人体造成严重的副作用，如膜岛素耐受和=致作用等，因此临床上肥胖症和糖 尿病的治疗急需安全、高效、廉价的新型药物。
[0003] 瘦素（L巧tin)是由脂肪组织分泌的激素类物质，通过六种Leptin受体参与机体 的脂肪代谢和食欲调节。本世际初期，瘦素被发现并且在肥胖老鼠模型上试验获得成功，弓I 起科学界的轰动，预示着生物技术为全球数亿的肥胖患者找到了减肥新药。1999年科学家 研究发现，人源瘦素蛋白的第116 - 130个氨基酸组织的多肤片段具有明显的脂肪降解活 性。随后，美国科学家率先进行第一次瘦素蛋白人体实验，然而在73个受试的肥胖患者中， 大部分患者的减肥效果不明显，只有2名患者在24周内减去35磅，该说明用野生型人源瘦 素蛋白很难得到理想的减肥效果。
【发明内容】
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[0004] 本发明的第一个目的是提供一种具有非常好的脂肪细胞降解活性的C螺旋区突 变的瘦素活性肤。
[0005] 本发明的C螺旋区突变的瘦素活性肤，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种上述C螺旋区突变的瘦素活性肤的编码基因。
[0007] 本发明的第=个目的是提供上述C螺旋区突变的瘦素活性肤在制备降解脂肪细 胞药物、减肥药物或降血糖药物中的应用。
[000引本发明对人源Leptin的氨基酸序列进行修饰，W提高其脂肪降解的效率。利用化 学方法分别合成C螺旋区突变的瘦素活性肤，尽可能的降低蛋白质空间结构对其活性的影 响，从而提高对脂肪细胞的祀向性和降解作用，实际结果表明，本发明的C螺旋区突变的瘦 素活性肤的脂肪细胞降解活性明显优于阳性对照-人源瘦素蛋白（H-LE巧和市售药物罗格 列酬（Rosiglitazone,Ros)，其降脂活性具有明显的浓度依赖性和细胞分化时期的依赖性， 在脂肪细胞分化前期（Preadipocytes)、分化期值0-D2)和成熟脂肪细胞期值9)S个时期 均具有明显的细胞裂解作用，并且效果显著优于两个阳性对照（H-LEP和罗格列酬），从而 为研制新型、高效、廉价的减肥和降血糖药物提供候选祀标。
【附图说明】：
[0009] 图1是C螺旋区突变的瘦素活性肤的设计.A:W人源Leptin序列为模板模拟构建 蛋白质S维结构图；B:人源Leptin3号外显子（上）与C螺旋区突变的瘦素活性肤（下） 的氨基酸序列比对及功能分区.* ;突变位点；
[0010] 图2是C螺旋区突变的瘦素活性肤活性分析.3T3-L1前脂肪细胞降脂活性分析 (MTT检测）.阳P-C:C螺旋区突变的瘦素活性肤，其后的10-6、1〇-\ 10-11分别指的是C螺旋区 突变的瘦素活性肤的浓度为;h-leP;人源瘦素蛋白（阳性对照1)，10^9是 指 1〇-9M;Ros;罗格列酬Rosiglitazone(阳性对照 2);Control;阴性对照。Preadipoc}ftes; 诱导分化前期；D0-D2 ;诱导分化第0-2天（分化初期）；D9 ;诱导分化第9天（成熟脂肪细 胞期）。统计分析；a,阳性对照化-LEP/Ros)VS.阴性对照（Control)，阳性对照的脂肪细胞 裂解活性显著优于阴性对照P<〇. 05 ;b，PEP-CVS. H-LEP，阳P-C的脂肪细胞裂解活性显著 优于H-LEP,P<0. 05 ;c,PEP-CVS. Ros，且阳P-C的脂肪细胞裂解活性显著优于Ros,P<0. 05 ; *，P<0.01。
【具体实施方式】：
[0011] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0012] 实施例1;
[0013] 1.材料与方法
[0014] 1. 1C螺旋区突变瘦素活性肤的设计与合成
[0015] W人源Leptin氨基酸序列为模板，根据突变位点的亲/疏水性质变 化情况在其功能区域设计一条C螺旋区突变的瘦素活性肤，其氨基酸序列为： RNAMQVSNDMKNLRE化QVLAFSN(具体如SEQIDNO. 1所示）。C螺旋区突变的瘦素活性肤交由 上海生工生物工程有限公司合成，经HPLC检测，化学合成的C螺旋区突变的瘦素活性肤的 浓度>97. 78%，满足后续活性分析的要求。用质谱法检测合成C螺旋区突变的瘦素活性肤 的准确性，确认其氨基酸序列为RNAMQVSNDMKNLRE化QVLAFSN(具体如SEQIDNO. 1所示）。
[0016] 1.2瘦素活性肤的体外降脂活性分析
[0017] W 3T3-L1前脂肪细胞系为模型，在细胞水平分析合成C螺旋区突变的瘦素活性肤 的脂肪降解活性。具体操作如下：
[001引 1.2.1实验设计
[0019] (1)分组：
[0020] a:分化前期（Preadipoc}ftes);
[0021] b:分化初期D0-D2(诱导分化第0-2天）；
[002引C:成熟脂肪细胞D9 (诱导分化第9天）；
[0023] (2)瘦素多肤及对照
[0024]a.C螺旋区突变的瘦素活性肤（PEP-C);用纯净水稀释成10-3M，-20°C保存备用。 实验开始后，工作浓度为l(T6M、i(r9M、i〇4iM3个浓度梯度。
[0025] b.阳性对照1 ;H-LEP，重组人源瘦素（L巧tin)蛋白（10221-HNAE，北京义翅神 州生物技术有限公司），用纯净水稀释成1(T6m，-2(Tc保存备用。实验开始后，工作浓度为 10-9M。
[0026] C.阳性对照 2 ;Ros，罗格列酬（Rosiglitazone,R2408,Sigma)，用DMSO稀释成浓 度为2518yM的贬存液，-20°C保存备用。实验开始后，用细胞培养液稀释成0. 5yM的工作 液。
[0027] d.阴性对照（Control);等量的PBS
[002引 （3)细胞分化诱导液
[0029] a.细胞分化诱导液I;含有 0. 5uMIBMX(3-Isobut}d-l-methylxanthi ne, 15879,Sigma)，ljiM地塞米松（dexamethasone,D4902,