绿盲蝽水溶性海藻糖酶单克隆抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及抗体工程农业科学技术领域，具体设及一种绿盲睹水溶性海藻糖酶单 克隆抗体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 绿盲睹Apolyguslucorum化emiptera:Miridae)属半翅目盲睹科，是棉花、蔬菜、 果树、牧草等多种农作物上的重要害虫。近年来，由于转化基因棉的大面积种植和农业产 业结构的调整等原因，绿盲睹种群数量急剧上升，加之长期依赖化学农药防治，致使绿盲睹 的抗药性日渐增强，目前农业生产上的绿盲睹防控面临严峻挑战，急待开拓减少化学农药 使用的新型无公害防控手段。迄今，多种新型昆虫生长调节剂已应用到防治绿盲睹的危害 中，如氣铃脈等第=代杀虫剂，显示出较好的杀虫效果。但是，由于该些农药的特异性祀标 表达量的差异，可显著影响其药效。水溶性海藻糖酶（solubletrehalase，Tre-1)是多种 昆虫生长调节剂的祀标基因，也是绿盲睹体内一种重要的水解酶。绿盲睹水溶性海藻糖酶 (AlTre-1)基因在不同龄期、不同组织中的蛋白表达量均不相同，导致昆虫生长调节剂施用 后，对祀标基因水溶性海藻糖酶的抑制效果出现较大差异，从而可引起农药的使用效果下 降。因此要求有灵敏度高，特异性好的蛋白检测技术来分析绿盲睹体内水溶性海藻糖酶的 表达量，指导该些昆虫生长调节剂的使用时间。目前，应用在昆虫蛋白检测的方法主要有 E化SA和Westernblot。
【发明内容】
[0003] 发明目的；本发明的第一个目的是提供一种绿盲睹AlTre-1单克隆抗体。
[0004] 本发明的另一个目的在于提供一种绿盲睹AlTre-1单克隆抗体的制备方法。
[0005] 本发明的又一个目的是提供一种绿盲睹AlTre-1单克隆抗体的化LSA检测方法。
[0006] 本发明的又一个目的是提供一种绿盲睹AlTre-1单克隆抗体的Westernblot检 测方法。
[0007] 本发明的又一目的是提供一种绿盲睹AlTre-1单克隆抗体的抗体特异性检测方 法。
[0008] 技术方案；为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种绿盲睹AlTre-1单 克隆抗体，将重组AlTre-1蛋白抗原免疫小鼠后制得。
[0009] 一种绿盲睹AlTre-1单克隆抗体的制备方法，包括W下步骤：
[0010]a、抗原处理：取纯化后的重组AlTre-1蛋白抗原与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化 得到首次免疫抗原；弗氏不完全佐剂和重组AlTre-1蛋白抗原等体积混合得到第二、=和 四次免疫抗原；
[0011]b、动物免疫；采用皮下多点注射法免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠；首次免疫采用 首次免疫抗原；间隔21天后第二次免疫采用第二次免疫抗原；间隔35天后第=次免疫采 用第=次免疫抗原；间隔49天后第四次免疫采用第四次免疫抗原，末次免疫后第7天，耳静 脉采血1ml，ELISA检测抗血清效价，选取效价大于1:10000的2只小鼠进行细胞融合过程 中脾细胞的制备；
[0012] C、骨髓瘤细胞的制备；于细胞融合前一周，用含10%FBSDMEM的培养基扩大培养 SP2/0细胞。在融合当天收集SP2/0细胞，100化pm，5min离屯、后弃上清，然后加入20mlDMEM 培养基，吹散细胞后计数；
[0013]t脾细胞的制备；将上述b过程中选取的小鼠在融合前3天终免，于腹腔注射抗原 100yg，融合当天用颈椎脱白法安乐死要融合的小鼠，75 %酒精浸泡5min后无菌取脾脏， 把脾脏放入内有10mlDMEM培养基的培养皿中，取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛 网上，用注射器内屯、研磨脾脏，加入DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿 中，将细胞移至10ml离屯、管中，用不含血清的DME：M洗脾细胞两次，100化pm离屯、5min后收 集脾细胞计数；
[0014]e、细胞融合；混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1 ; 20,用DMEM基础培养基稀释混合细胞，100化pm离屯、5min后弃上清，将细胞均匀后加入 0. 8ml50%阳G，反应90秒，再加入25mlDMHM培养基后37°C水浴锅中反应lOmin，1000巧111 离屯、5min后弃上清，加入HATDMEM培养基，然后将融合的细胞铺到96孔板中，每孔 100y1，然后将细胞培养板放到C〇2培养箱中培养，融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率达 到50%W上，细胞生长状态良好。融合10天后开始进行筛选检测；
[0015]f、融合筛选：于检测的前一天，用PBS包被5yg/ml抗原于化ISA板后过夜。次日 吸取细胞上清100y1/孔进行ELISA检测，根据ELISA结果，判断阳性孔，W样品孔OD值/ 阴性孔OD值> 2. 1时，则判定为阳性孔，用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二 次确认检测，进一步确认阳性孔，确定后的阳性孔细胞进行亚克隆；
[0016]g、亚克隆：吹打阳性孔中细胞后计数，加入N/4mlDMEM培养基（N为细胞数），取 100y1阳性孔细胞悬液到离屯、管中，吹匀后留1ml，补加DMEM到4ml后吹匀，留100y1在管 底，加入DMEM至5ml，混匀后滴加至96孔板的A、B、CS行，每孔一滴，管底留1. 8~2. 0ml 左右，补加DMEM至5ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、FS行，每孔一滴，管底留1. 5~1. 8ml 左右，补加DMEM至3ml，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7~10天后在显微镜下 观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，挑取阳性单克隆细胞进行再次亚克隆，检 测至100%阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株，从而获得单克隆抗体。
[0017] 其中，上述步骤b中的首次、第二、S或四次免疫抗原剂量均为lOOyg/只。
[0018] 本发明中采用的重组AlTre-1蛋白的专利号为化201310227473. 0,发明名称为 "一种绿盲睹水溶性海藻糖酶、其编码序列、载体和菌株及应用"中的制备方法制备得到的。
[0019] 一种绿盲睹AlTre-1单克隆抗体的化ISA检测方法，包括W下步骤：用碳酸盐包 被重组AlTre-1蛋白抗原，包被浓度为5yg/ml，4°C解育过夜，取出抗原后用PBST洗漆液 洗漆S次，然后加入封闭液，取出再用PBST洗漆液洗漆S次，将小鼠血清（一抗）首先按照 1:500稀释，然后3倍稀释，37°C解育1小时；取出用PBST洗漆液洗漆S次，加入辣根酶标 记兔抗小鼠-HRP(二抗），1:5000稀释，37°C解育60min;取出用PBST洗漆液洗漆四次，3分 钟/次，最后加入TMB显色液100y1/孔，反应15min，加入100y1Imol/L盐酸终止反应， 在450nm波长下测定0D值，评价效价。
[0020] -种绿盲睹AlTre-1单克隆抗体的Westernblot检测方法，包括W下步骤：取 AlTre-1重组蛋白按梯度上样，上样完毕后，聚丙締酷胺凝胶先75V跑完积层胶，再将电压 升至115V直到电泳结束，电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜1. 5小时。电转 结束后，取下膜后先用PBS洗漆4次，每次5分钟，然后置于37°C，5%脱脂奶粉封闭液中封 闭1小时。用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37°C反应1小时，洗膜4次，每次5分钟， 用含5%牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37°C反应1小时，洗膜E化显影。
[0021] 一种绿盲睹AlTre-1单克隆抗体的抗体特异性检测方法，包括W下步骤；取绿盲 睹若虫提取总蛋白，通过RIPA裂解获得上清，按梯度上样采用聚丙締酷胺凝胶电泳，电泳 结束后，取下凝胶进行转膜，取下膜后先用PBS缓冲液洗漆，然后将膜置于封闭液中封闭， 然后用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中反应，洗膜，封闭液稀释二抗，膜在二抗中反应， 洗膜E化显影。
[0022] 本发明采用的封闭剂为脱脂奶粉。
[0023] 有益效果：本发明相对于现有技术，具有W下优点：将原核表达纯化的AlTre-1 单重组蛋白应用于免疫小鼠后制备了单克隆抗体，在通过利用ELISA法确定了该多克隆 抗体的效价后，发明人采用Western blot法发现该单克隆抗体能特异性识别原核表达的 AlTre-1重组蛋白，可产生特异性免疫反应。基于此，发明人还建立了一套高效、高灵敏度和 准确的Western bl