一种产高纯度2-酮基-d-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，特别涉及一种产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷 氏菌株。
【背景技术】
[0002] 2-酮基-D-葡萄糖酸（2-keto-D-gluconic acid，2KGA)是葡萄糖酸的一种重要衍 生物。2-酮基-D-葡萄糖酸可作为饲料的富钙添加剂、洗涤剂的促净剂、水机增塑剂和摄影 显影剂等。同时，2-酮基-D-葡萄糖酸还是合成糠醛、D-阿拉伯糖、D-异抗坏血酸及D-异 抗坏血酸钠的前体。其中合成D-异抗坏血酸(钠）是其最主要的用途。
[0003] 异抗坏血酸为白色至浅黄色结晶或结晶性粉末，无臭，味酸，具有极强的还原性， 极易溶于水，广泛应用于食品、医药、纺织、建材、日用化工等行业，其中，最主要用途是应用 于食品加工行业。由于目前异抗坏血酸(钠）在天然食品中不存在，市场上的产品均为人工 合成产品。目前异抗坏血酸生产主要是利用2-酮基-D-葡萄糖酸经酯化、转化、精制等过 程得到成品。
[0004] 2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法主要有酶法、化学合成法和发酵法等三 种：（1)酶法。在在P比喃糖-2-氧化酶（pyranose-2-oxidase)、葡萄糖-2-氧化酶 (glucose-2-oxidase)和葡萄糖-1-氧化酶（glucose-1-oxidase)中任何一种酶的催化下， 用〇 2将溶液中的D-葡萄糖氧化为D-葡糖醛酮或D-葡萄糖酸-S -内醋，然后选择吡喃 糖-2-氧化酶和葡萄糖-1-氧化酶的一种酶，催化氧化D-葡糖醛酮或D-葡萄糖酸-S -内 酯为过氧化氢和2-酮基-D-葡萄糖酸；（2)化学合成法。以葡萄糖为起始原料，在Pt/Pb催 化剂存在的条件下，用〇 2将葡萄糖氧化为2-酮基-D-葡萄糖酸；(3)发酵法。利用细菌直接 转化发酵培养基中的葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸(魏转，余泗莲，刘正安，孙文敬，周强， 李中兵。2-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产研宄进展[J].食品科学，2008,29(8):636-639)。
[0005] 由于生产成本、生产安全性等方面的原因，目前在工业生产中通常采用细菌发酵 的方法。目前，国外对于发酵法生产发酵法2-酮基-D-葡萄糖酸的研宄菌属主要是食爬虫 假单胞菌、欧文氏菌、沙雷氏菌、葡萄糖酸杆菌、醋酸杆菌，工业生产菌株主要是荧光假单胞 菌、粘质沙雷氏菌和鸡血藤欧文氏菌。国内对于发酵法生产发酵法2-酮基-D-葡萄糖酸的 研宄菌属主要是荧光假单胞菌(余泗莲，汪美生，孙文敬，崔凤杰，魏转，余斌，周强，齐向辉， 王亮.荧光假单胞菌JD1202利用大米淀粉水解糖连续发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸[J]. 中国食品添加剂，2012, 6:191-197.)、沙雷氏菌、球状节杆菌、恶臭假单胞菌、产酮产碱菌， 工业生产菌株主要是荧光假单胞菌和球状节杆菌。生产菌株的转化率一般在90%左右。
[0006] 虽然发酵法是目前2-酮基-D-葡萄糖酸生产的主要方法，但是由于现用生产菌的 原料利用率不高，发酵转化率偏低，产品纯度较低，生产损耗大，且容易被噬菌体污染，因此 有必要筛选具有转化率高、产品纯度高、发酵速率快等优良特性的新2-酮基-D-葡萄糖酸 生产菌，以取代或部分取代目前的生产菌，从而提高生产效率，降低成产成本。
【发明内容】
[0007] 为解决现有技术发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸中由于菌种问题导致转化率低、 纯度低、生产损耗大且易被噬菌体污染的问题，本发明提供了一种产高纯度2-酮基-D-葡 萄糖酸的粘质沙雷氏菌株。
[0008] 本发明的技术方案为： 产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)SDSPY_136菌 株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No :10548,其保藏时间为：2015年2月9日。
[0009] 所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens) SDSPY-136菌株，其获取步骤为：1)由土样中的微生物经培养、筛选获得出发菌株，S卩，粘质 沙雷氏菌（Serratia marcescens) S-136 ;2)将出发菌株接种于种子培养基培养，经诱变、 筛选获得耗糖速率稳定、2-酮基-D-葡萄糖酸产量及纯度都有提高的突变菌株SD-136 ;3) 将突变菌株SD-136接种于种子培养基培养，经诱变、筛选、复筛，获得遗传性质稳定、2-酮 基-D-葡萄糖酸产量最高达104.6g/L，转化率高达95. 1%的突变菌株SDSPY-136。
[0010] 进一步的，步骤1)中由土样中的微生物经富集培养、溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板 筛选、斜面培养后，接入发酵培养基，筛选获得产高纯2-酮基-D-葡萄糖酸的出发菌株，命 名为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens) S-136 ;步骤2)中，出发菌株对数生长中期的 菌体，做成细胞浓度为IX 108 - 10 9cfu/ml的菌悬液，在紫外灯照射下诱变，间隔挑取不同 紫外灯照射时间的样品，进行溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板筛选、斜面培养后，发酵筛选，获 得突变菌株SD-136 ;步骤3)中，突变菌株SD-136对数生长中期的菌体，做成细胞浓度为 1 X 108 - 10 9cfu/ml的菌悬液，在亚硝基胍处理液的作用下诱变，间隔挑取不同处理时间的 样品，进行平板筛选、斜面培养后，发酵筛选；发酵筛选的菌株进行发酵复筛，获得突变菌株 SDSPY-136。
[0011] 该保藏菌株的生物学特征是：在固体培养(分离培养基)平板上30°C培养24h后观 察，菌落可形成红色、表面光滑湿润的圆形菌落，微凸起，光学显微镜下观察菌体为近球形 短杆状，革兰氏染色呈阴性，无芽孢。用于菌体形态观察的固体培养基组成（g/L):蛋白胨 5,氯化钠5,牛肉膏3,琼脂18，pH值7. 0。上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙 英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。
[0012] 所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens) SDSPY-136菌株，能利用葡萄糖和海藻糖作为碳源，不发酵阿拉伯糖，葡萄糖发酵不产气体， 触酶阳性。
[0013] 该菌株生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌 系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。菌株CGMCCN0. 10584生理生化实验 结果详见表1。
【主权项】
1. 产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)SDSPY_136 菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为 CGMCC No : 10548,其保藏时间为：2015年2月9日。
2. 如权利要求1所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)SDSPY-136菌株，其特征在于，其获取步骤为：1)由土样中的微生物经培养、筛 选获得出发菌株，即，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)S_136 ;2)将出发菌株接种于种 子培养基培养，经诱变、筛选获得耗糖速率稳定、2-酮基-D-葡萄糖酸产量及纯度都有提高 的突变菌株SD-136 ;3)将突变菌株SD-136接种于种子培养基培养，经诱变、筛选、复筛，获 得遗传性质稳定、2-酮基-D-葡萄糖酸产量最高达104. 6g/L，转化率高达95. 1%的突变菌 株 SDSPY-136。
3. 如权利要求2所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens) SDSPY-136菌株，其特征在于：步骤1)中由土样中的微生物经富集培养、溴甲 酚紫-碳酸钙筛选平板筛选、斜面培养后，接入发酵培养基，筛选获得产高纯2-酮基-D-葡 萄糖酸的出发菌株，命名为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens) S-136 ;步骤2)中，出发 菌株对数生长中期的菌体，做成细胞浓度为I X IO8 - 10 9cfu/ml的菌悬液，在紫外灯照射下 诱变，间隔挑取不同紫外灯照射时间的样品，进行溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板筛选、斜面培 养后，发酵筛选，获得突变菌株SD-136 ;步骤3)中，突变菌株SD-136对数生长中期的菌体， 做成细胞浓度为IX IO8 - l〇9cfu/ml的菌悬液，在亚硝基胍处理液的作用下诱变，间隔挑取 不同处理时间的样品，进行平板筛选、斜面培养后，发酵筛选；发酵筛选的菌株进行发酵复 筛，获得突变菌株SDSPY-136。
4. 如权利要求1所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serrat