一株枯草芽孢杆菌及其代谢产物与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其代谢产物与应用，尤其是涉及一株具有除草活 性的枯草芽孢杆菌及其代谢产物大豆蛋白发酵液与应用，属于天然植物材料用于农业植物 保护、防除农作物杂草的技术领域。
【背景技术】
[0002] 目前，种植业中对有害生物的生物防治主要针对植物病害和害虫危害，而对杂草 的生物防治方法应用较少。
[0003] 杂草危害是影响农业生产的主要问题之一，多年来的应对方法以化学防治为主， 而随着化学除草剂的长期和过度使用，其带来的环境问题和对农作物品质的影响已经日益 受到关注，寻求天然的植物源除草剂是解决这一问题的有效途径。相关研宄表明，农田和园 林生态系统中存在多种植物间的生化他感作用，某些植物残体的分解产物也能抑制植物种 子萌发和生长，利用植物间的生化他感作用控制杂草是当前杂草防治研宄的热点。
[0004] 稗草是一种一年生草本植物，一般长在稻田里、沼泽、沟渠旁、低洼荒地，生长在稻 田时，它长在稻子和稻子的间隙里，和稻子一起争养分，争空间，稗子和稻子外形极为相似， 难以与稻子区分，因此稗子属于恶性杂草。
[0005] 20世纪90年代初，美国Christians等发现了玉米蛋白粉对植物种子萌发时生 根的抑制作用，并将其作为无公害植物源除草剂应用在草坪和有机农业的杂草防治上；用 碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉制备的水解多肽比玉米蛋白粉具有更高的生根抑制活性，Liu 等从玉米蛋白粉水解物中分离出了高除草活性的多肽。之后更多相关研宄表明，包括大豆 蛋白在内的多种天然蛋白材料的水解产物同样具有除草活性。目前国内外的相关研宄中， 虽然使用蛋白酶水解蛋白材料能提高其对杂草的抑制活性，但蛋白酶的酶促水解反应对温 度、pH等条件要求相对严格，在不良条件下存在蛋白酶易失活的问题，另外使用蛋白酶还存 在成本过高的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株枯草芽孢杆菌及其 代谢产物与应用，利用枯草芽孢杆菌对大豆蛋白进行纯菌株发酵，从而提供一种具有除草 活性的大豆蛋白发酵液，成本较低。
[0007] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是： 本发明之枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌L-5 L-5)，该菌种于 2015年02月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所）保藏，菌种保藏号为CGMCC No: 10505。
[0008] 本发明中所述枯草芽孢杆菌L-5是通过以下方法分离得到的： (1)分离纯化：称取5. 0g酱油渣(酱油渣采集自湖南长沙本地酱油厂)，加入100毫升 无菌生理盐水中，震荡2小时后再用生理盐水梯度稀释；取稀释倍数105~108的菌液各100 微升，将其分别均匀涂布于LB固体培养基上，37°C倒置培养24小时，每个稀释度各两个重 复；挑取不同菌落形态的菌株进行反复划线纯化，直至菌落形态一致和显微镜镜检特征相 同； (2) 菌株的筛选：挑取已纯化的菌株置于脱脂奶粉琼脂培养基37°C培养，挑取有明显 水解圈的菌落进行单独培养，并观测其在脱脂奶粉琼脂培养基上培养3天的降解透明圈大 小，选取一株获得最大降解透明圈（透明圈直径达12毫米）的菌株，命名为L-5; (3) 菌株的鉴定：对菌株L-5进行形态、生理、生化特征的测定，并进行16SrDNA测序 分析；16SrDNA同源性分析表明，菌株L-5最接近于枯草芽孢杆菌达 到100%，结合菌株L-5形态学特征与生理生化实验结果，将菌株L-5鉴定为枯草芽孢杆菌 即为枯草芽抱杆菌L-5。
[0009] 所述菌株L-5的特征：菌株L-5在LB固体培养基上形成的菌落表面粗糙，多褶皱， 不易挑起；呈不透明乳白色；菌体杆状，革兰氏染色为阳性；无荚膜、周生鞭毛。菌株L-5明 胶液化、淀粉水解、M.R、V.P、接触酶、氧化酶、硝酸盐还原实验均表现为阳性，吲哚、硫化氢、 厌氧生长实验均表现为阴性。16SrDNA同源性分析表明，菌株L-5最接近于枯草芽孢杆菌 (ifeciByssyki/is)，达到100%，结合菌株L-5形态学特征与生理生化实验结果，将菌株 L-5鉴定为枯草芽孢杆菌
[0010] 本发明之枯草芽孢杆菌的代谢产物，即利用枯草芽孢杆菌作为发酵剂，其制备方 法，具体包括以下实施步骤： (1) 将菌株枯草芽孢杆菌L-5在LB固体培养基上培养12-24小时，接种于 100mL/250ml种子培养基中，种子培养基配方为胰蛋白胨8-12克、酵母提取物3-5克、NaCl 8-12克、蒸馏水900-1100毫升，pH值6. 8-7. 2, 121°C灭菌20-30分钟，接种后于30°C下培 养12-18小时至对数期； (2) 取对数期菌株种子液接种于发酵培养基中，接种量4wt%，发酵培养基配方为：大 豆分离蛋白粉18-22克、NaC18-12克、蒸馏水900-1100毫升，pH值6. 8-7. 2,121 °C灭菌 20-30分钟，冷却后接种，然后在30°C、140-160rpm条件下震荡培养72 - 120小时，培养 完成后用纱布过滤即获得大豆蛋白发酵液。
[0011] 本发明之枯草芽孢杆菌代谢产物的应用，即枯草芽孢杆菌L-5的大豆蛋白发酵 液，用于防除水田杂草。其大豆分离蛋白粉的发酵液对初萌稗草具有明显生根抑制作用。发 酵72小时的大豆蛋白发酵液，在每升溶液含2. 0克大豆蛋白发酵液的浓度下，对初萌稗草 抑制率达到94. 8%，田间每亩施用质量浓度2. 0克每升的溶液1. 5-3升，对稗草的防治效果 达89. 6%以上。
[0012] 本发明的有益效果是： 本发明利用纯菌株发酵方法，制备具有除草活性的大豆蛋白发酵液，能提供一种制备 天然生物除草剂的方法，制备出的发酵液安全，环保，不产生毒副作用，具有重要生态意义。
[0013] 本发明使用枯草芽孢杆菌L-5对大豆分离蛋白进行发酵，发酵液对稗草尤其是初 萌稗草的生根具有明显抑制活性；发酵液对已成熟的作物根系则没有影响，而且，使用降解 菌对大豆分离蛋白的发酵条件相对简单，常温条件下即可进行。另外，相对于蛋白酶，使用 菌株发酵，成本较为低廉。因此，本发明利用枯草芽孢杆菌L-5发酵大豆分离蛋白来除草， 相对于使用蛋白酶进行水解，工艺更为简单，成本更为低廉，更适宜大规模实际应用。
[0014] 大豆蛋白是一种天然植物材料，几乎不产生任何环境污染，来源丰富且含氮量高， 是农作物有机肥来源之一，因此，利用本发明，可以将其作为天然的植物源除草剂且可以和 有机肥结合，应用于农业杂草防治。
[0015] 因此，利用大豆蛋白发酵液作为天然除草剂应用于杂草防治，特别适用于水稻田 中稗草的防治，可以减少化学除草剂的环境污染，改善有机种植产业，具有良好的经济，生 态和社会效益，前景广阔。
【附图说明】
[0016] 图1为0. 5mg/mL浓度下不同发酵时间所得大豆蛋白发酵液对稗草的根抑制活性 影响图。
[0017] 微生物保藏情况说明 枯草芽孢杆菌L-5很L-5)，该菌种于2015年02月02日在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研宄所）保藏，菌种保藏号为CGMCCNo:10505。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0019] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制