一种用于卵母细胞、皮肤成体干细胞培养的组合物及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于卵母细胞、皮肤成体干细胞培养的组合物及应用。
【背景技术】
[0002] 卵母细胞（oocyte)在母体的卵巢上产生。卵巢上滤泡（follicle)包括卵母细胞 与滤泡细胞（follicularcells)。在滤泡的生长过程中，初级卵母细胞（primaryoocyte) 停止在减数分裂第一次成熟分裂的前期，当青春期开始，在滤泡刺激素（FSH)的作用下，祖 细胞初级卵母细胞体积增大，并在卵母细胞的外周形成透明带，滤泡细胞生长成多层细胞， 包围卵母细胞，并在滤泡中形成滤泡腔，故称次级滤泡（secondaryfollicle)。在成熟滤泡 中，初级卵母细胞在激素LH和其他因子的作用下，完成第一次减数分裂，形成次级卵母细 胞，或成熟的卵母细胞，并排放第一极体，极体位于卵母细胞与透明带之间的卵周隙中。这 是滤泡壁破裂，卵母细胞从成熟的滤泡中排出，加入输卵管。如果输卵管中存在能活的精 子，就会发生受精，产生受精卵（fertilizedegg)，或称胚胎（embryo)。胚胎经过分裂与发 育变成囊胚，并迀移到母体的子宫着床，形成胎儿（fetus)。
[0003] 初级卵母细胞属于卵母细胞的祖细胞，它会在一定因子的作用下，定向的分化成 成熟的卵母细胞，并具有受精的能力。生育期的妇女，每隔28天左右排放一个卵子，偶尔排 放两个或多个卵子。奶牛与人类一样，是单胎动物，每次一般排放一个卵子。其他的动物属 于多胎动物，如绵羊，山羊每次会排放3~5个卵子，家猪，家兔，小鼠，大鼠会排放8~10个，或 更多的卵子。不管是单胎或者多胎动物，在每个排卵周期中，有一批（20~100个）的卵母祖 细胞启动定向分化为成熟卵母细胞的过程。同时原始滤泡向初级滤泡，以及次级滤泡的生 长与发育。在此过程中，单胎动物的卵巢上大量卵母细胞都会出现细胞的凋亡（programmed death)，导致闭锁的滤泡（atresic follicles)，只有一个卵母细胞排卵，其他的卵母细胞 都会凋亡而退化，无法排卵或排卵但无法受精。多胎动物的卵巢上，同样出现卵母细胞的凋 亡与退化。这样会造成大量卵母细胞的损失，也是造成人类不孕不育的原因之一。
[0004] 体外受精技术（i/?n'trofertilization，IVF)是繁殖生物学中最有成就的技术， 其中卵母细胞的体外成熟（i/?ritromaturation，IVM)技术，就是将卵母祖细胞能够最大 限度地降低其细胞凋亡的过程，并向成熟卵母细胞的方向分化，保证卵子的正常受精，发育 成胚胎，从而增加可受孕的胚胎质量与数量。
[0005] 虽然体外受精技术得到了广泛地应用，但胚胎成熟比例仍然很低，主要受以下几 个方面的影响： 1)卵母细胞的体外成熟率低，即细胞核的成熟与细胞质的成熟程度较低。
[0006] 2)受精卵向胚胎发育的过程中： 卵子的分裂率低； 胚胎发育到桑椹和囊胚的比率低。
[0007] 为此，我们提供了一种组合物，该组合物能够促进卵母细胞的体外成熟培养，促进 体外受精的受精卵向胚胎发育。同时，我们通过动物皮肤组织与细胞培养的实验，发现该组 合物能够促进皮肤成体干细胞再生与增殖。
[0008] 皮肤有极强的修复和再生能力，这与皮肤成体干细胞（skinadultstemcells) 的存在具有直接的关系。目前，皮肤成体干细胞的临床应用主要表现在几个方面： (1)在细胞治疗中的应用。当皮肤受到外伤、疾病等的损伤时，位于皮肤表皮基底层和 毛囊隆突的皮肤成体干细胞就会在内外源因素的调控下，及时增殖分化生成相关细胞，以 修复机体受损表皮、毛囊等结构。
[0009] (2)在组织工程中的应用。人工真皮是利用组织工程技术形成商品化用于临床的 真皮替代物，它可诱发正常的皮肤愈合过程，已用于治疗大面积烧伤病人的暂时性皮肤覆 盖及慢性皮肤溃疡的治疗。
[0010] (3)在基因治疗中的应用。干细胞因具有高度自我更新和多向分化潜能，因此一直 为基因治疗首选的靶细胞。将表皮干细胞作为皮肤遗传性疾病等基因治疗的靶细胞已成为 可能。将外源基因通过逆转录病毒导入表皮成体干细胞并植入体内后，机体可长期维持转 导基因的表达，这就为表皮成体干细胞应用于基因治疗提供了可靠的依据。
[0011] 上述应用均涉及皮肤成体干细胞的体外扩增、培养，然而皮肤成体干细胞体外培 养中易分化为成纤维细胞，使得自体皮肤成体干细胞和由自体皮肤成体干细胞构造的人造 皮肤的应用在临床上较难实现，上述组合物的应用能够有效解决这一问题。
【发明内容】
[0012] 针对上述问题，本发明提供了一种用于卵母细胞、皮肤成体干细胞培养的组合物 及应用，该组合物能够提高卵母细胞的体外成熟率，并提高卵子的分裂率、胚胎发育到桑椹 和囊胚的比率，进而大幅促进体外受精的受精卵向胚胎发育。同时，该组合物能够有效抑制 皮肤成体干细胞向成纤维细胞分化，或维持皮肤成体干细胞的自我更新与再生。
[0013] 半胱胺（cysteamine)，又称2-巯基乙胺或巯基乙胺。分子式：C2H7NS，分子量： 77. 14,属于一种渗透性强的小分子，还原剂，具有抗氧化的作用。尤其是当机体皮肤受到紫 外光或X线照射时，细胞产生大量的游离羟基（0H)，半胱胺与游离羟基作用，从而产生极 强的抗氧化作用，达到保护皮肤的机能以及维护机体的生理平衡。
[0014]Rho激酶抑制剂Y27632,分子量320. 26,是一个Rho相关激酶ROCK的抑制剂。 Y27632具有防止细胞凋亡，并提高分离的人类胚胎干细胞存活率和克隆效率的功能，并可 提高胚胎干细胞源性神经前体移植的存活率。
[0015] 白血病抑制因子（LeukemiaInhibitorFactor,LIF)是一种可以通过抑制自身 分化来促进胚胎干细胞长期维持的淋巴因子，主要应用于胚胎干细胞的体外培养和研宄。 LIF可与胚胎干细胞表面的LIFR/gpl30受体结合，通过几个重要的信号通路起作用：LIF激 活JAK/STAT通路抑制ES细胞分化；LIF激活PI3K通路维持ES细胞的自我更新；LIF激活 MAPK(MitogenActivatedProteinKinase，分裂原激活蛋白激酶）级联通路。
[0016] 本发明提供了一种用于卵母细胞以及皮肤成体干细胞培养的组合物，其包括半胱 胺。
[0017] 进一步地，所述组合物还包括LIF。
[0018] 进一步地，所述组合物还包括LIF和Y27632。
[0019] 更进一步地，所述组合物中半胱胺、LIF和Y27632配比为（Immol-lOOmmol): (10IU-103IU):(0?lmmol-lOmmol)。
[0020] 本发明提供了一种用于卵母细胞、IVF受精卵或IVF胚胎培养的培养液或培养基， 其特征在于：包含上述技术方案中任一所述的组合物。
[0021] 进一步地，所述组合物包含半胱胺和白血病抑制因子，所述培养液或培养基中半 胱胺浓度为10-200mM，白血病抑制因子浓度为102-2X103IU/mL; 所述组合物包含半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632,所述培养液或培 养基中半胱胺浓度为10-200禮，白血病抑制因子浓度为102-2X103IU/mL，Rho激酶抑制 剂Y27632浓度为1-20禮。
[0022] 本发明提供了上述技术方案中任一所述的组合物在卵母细胞体外成熟培养、IVF 受精卵或IVF胚胎体外培养中的应用。
[0023] 进一步地，所述组合物包含半胱胺和白血病抑制因子，所述培养液或培养基中半 胱胺浓度为10-200mM，白血病抑制因子浓度为102-2X103IU/mL; 所述组合物包含半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制剂Y27632,所述培养液或培 养基中半胱胺浓度为10-200禮，白血病抑制因子浓度为102-2X103IU/mL，Rho激酶抑制 剂Y27632浓度为1-20禮。
[0024] 进一步地，所述卵细胞、IVF受精卵或IVF胚胎选自人或下述任何一种动物：山羊、 绵羊、奶牛、猪，家兔、小鼠、大鼠或豚鼠。
[0025] 本发明提供了一种用于皮肤成体干细胞培养的培养液，包含上述技术方案中任一 所述的组合物。
[0026] 进一步地，所述培养液或培养基中半胱胺浓度为5-500mM，LIF浓度为50-5X103 IU/mL，Y27632 浓度为 0? 5-50mM。
[0027] 本发明提供了上述技术方案中任一所述的组合物在皮肤成体干细胞、皮肤组织培 养中的应用。
[0028] 进一步地，培养液或培养基中半胱胺浓度为5-500mM，LIF浓度为50-5X103IU/ mL，Y27632 浓度为 0? 5-50mM。
[0029] 本发明提供了上述技术方案中任一所述的组合物在制备治疗创伤性皮肤缺损、皮 肤溃疡的药物或试剂中的应用。
[0030] 进一步地，所述药物或试剂中半胱胺浓度为5-500mM，LIF浓度为50-5X103IU/ mL，Y27632 浓度为 0? 5-50mM。