包含具有非经典生物活性的组氨酰-tRNA合成酶剪接变异体的组合物及方法
【专利说明】包含具有非经典生物活性的组氨酰-tRNA合成酶剪接变异 体的组合物及方法
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 119(e)主张于2009年3月16日提交的美国临时专利申 请61/160, 630和于2009年9月3日提交的美国临时专利申请61/239, 747的权益，所述专 利申请的全部内容通过援引并入本文中。
[0003] 关于序列表的说明
[0004] 与本申请有关的序列表以文本格式提供，代替书面版本，并通过援引并入本说明 书中。含有所述序列表的文本文件名称为120161_415PC_SEQUENCE_LISTING.txt。文本文 件大小为20KB，于2010年3月16日创建，并通过EFS-Web电子提交。
[0005] 发明背景 发明领域
[0006] 本发明大体上涉及组氨酰-tRNA合成酶（HRS)剪接变异体多核苷酸和多肽，包含 这些多核苷酸和多肽的组合物及其使用方法。
[0007] 相关技术说明
[0008] 催化tRNA分子氨酰化的氨酰-tRNA合成酶（AARS)蛋白质，对翻译过程中解码遗 传信息是必不可少的。每个真核tRNA合成酶由与原核tRNA合成酶密切相关的核心酶， 以及添加到氨基末端、羧基末端或插入到核心酶内部的其他结构域组成。例如，人类酪氨 酰-tRNA合成酶（TyrRS)具有不属于原核和低等真核生物TyrRS分子部分的羧基末端结构 域。
[0009] 已经证实有几个氨酰-tRNA合成酶具有不同于其参与翻译过程的非经典功能。例 如，微型酪氨酰-tRNA合成酶（mini-TyrRS)，即对应于第1-364位氨基酸残基、被多形核细 胞弹性蛋白酶和纤溶酶切割的TyrRS的N端结构域，是氨酰-tRNA合成酶（AARS)多功能 细胞因子样蛋白质和肽的成员。已证明微型-TyrRS在体外刺激中性粒细胞激活和趋化作 用，刺激内皮细胞增殖和迁移，并在鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)和小鼠基质胶检测（matrigel assay)中促血管生成。微型-TyrRS具有ELR基序，所述ELR基序和诸如IL-8的CXC-趋化 因子类似，可赋予微型-TyrRS趋化因子活性和血管生成活性。和其他含ELR的细胞因子类 似，所述基序的突变抑制微型-TyrRS对白细胞的结合和刺激，并抑制血管生成。
[0010] 此外，已证明TrpRS的截短形式具有血管生成性能。在正常人体细胞中，有两种可 检测的TrpRS形式：由全长分子（第1-471位氨基酸残基）组成的主要形式和次要的截短 形式。次要形式是通过前体mRNA(pre-mRNA)的可选剪接而使氨基末端结构域缺失所产生 的。已确定微型TrpRS的氨基末端为全长TrpRS分子第48位的蛋氨酸残基。或者，截短 TrpRS可以通过蛋白水解产生。例如，牛TrpRS在胰脏中高表达并分泌到胰液中，从而导致 产生截短的TrpRS分子。进一步的研究表明，微型-TrpRS抑制VEGF诱导的细胞增殖和迁 移（Wakasugietal.，Proc.Natl.Acad.Sci. 99:173-177(2002))。具体而言，鸡CAM实验 表明，微型-TrpRS可阻止VEGF的血管生成活性。相比之下，全长TrpRS不抑制血管生成。 因此，去除前48位氨基酸残基可显现出TrpRS抗血管生成活性。因此，与TyrRS-样，某些 形式的TrpRS具有除tRNA氨酰化以外的活性。
[0011]鉴于这些与可变形式TyrRS和TrpRS相关的、非经典的治疗相关活性的观察结果， 需要鉴定其他氨酰-tRNA合成酶蛋白质的生物相关形式和/或活性，以开发该蛋白质家族 的全部治疗潜力。因此，本发明满足这些需要，并提供其他相关的优点。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明大体上涉及具有非经典活性的分离的HRS剪接变异体多肽；编码HRS剪接 变异体多肽的HRS剪接变异体多核苷酸；与HRS多肽结合的结合剂；HRS多肽和多核苷酸的 类似物、变异体和片段，以及前述任一物质的组合物和其制备和使用方法。
[0014] 因此，根据一个方面，本发明提供具有至少一种非经典生物活性的分离的HRS剪 接变异体多肽，及其活性片段和变异体。本文所用的"非经典"活性，一般是指本发明HRS 多肽所具有的除氨酰化以外的活性，更具体地说，除了将组氨酸添加到tRNAms分子上以外 的活性。如本文所述，在某些实施方案中，本发明HRS多肽所显示的非经典生物活性可以包 括，但不仅限于，细胞因子产生调节、细胞增殖调节、凋亡调节、细胞信号传导调节、血管生 成调节、细胞迁移调节、细胞结合调节、细胞代谢调节等。
[0015] 在一个说明性实施方案中，本发明HRS剪接变异体多肽是至少包含HRS的WHEP结 构域，如人类全长HRS蛋白质的第3-43位氨基酸残基，的HRS片段。在另一个实施方案中， 本发明HRS剪接变异体多肽是至少包含HRS的反密码子结合结构域，如人类全长HRS蛋白 质的第406-501位氨基酸残基的HRS片段。在又一个实施方案中，HRS剪接变异体多肽是 缺失功能性氨酰化结构域，如人类全长HRS蛋白质的第54-398位氨基酸残基的HRS片段。 在一个更具体的实施方案中，HRS剪接变异体多肽至少包含WHEP结构域和反密码子结合结 构域，但缺失功能性氨酰化结构域。
[0016] 在一个更具体的实施方案中，本发明HRS多肽包含SEQIDN0 6、9或11中公布的 序列，或者是SEQIDN0 6、9或11所示序列或是的SEQIDN0 6、9或11所示多肽的连续 片段。需要说明的是，所述片段实质上可以基本上是任意长度的，只要其保留至少一种感兴 趣的非经典生物活性。例如，如本文进一步所述,这样的片段可以包含SEQIDN0 6、9或11 的至少约5、10、15、20、25、50、75、80或更多个连续氨基酸残基。
[0017] 在本发明的其他实施方案中，HRS多肽包含SEQIDN0s:6、9或11所示序列的活 性变异体（即保留至少一个感兴趣的非经典生物活性）。在一个更具体的实施方案中，活性 变异体是一种沿着其长度与SEQIDN0 6、9或11所示序列具有至少70%、80%、90%、95% 或99%同一性的多肽。
[0018] 在另一个具体实施方案中，本发明HRS多肽不是由全长人类HRS蛋白第1-48位残 基组成的多肽。
[0019] 根据本发明的另一个方面，提供了至少包含至少一个本文所述的HRS多肽和一个 异源融合伴侣的融合蛋白。
[0020] 根据本发明的另一个方面，提供了编码本文所述多肽和融合蛋白的分离的多核苷 酸，以及包含这种多核苷酸的表达载体和包含这种表达载体的宿主细胞。此外，还包括与 HRS多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸，如SEQIDN0:5、8或10的多核苷酸。在某些实施方 案中，寡核苷酸为引物、探针或反义寡核苷酸。其他实施方案涉及靶向HRS多核苷酸的RNAi 剂（RNAiagents)。在某些实施方案中，寡核苷酸或RNAi剂与HRS剪接变异体特有的剪接 点特异性地杂交，或靶向所述剪接点。
[0021] 根据本发明的另一个方面，提供了对本发明HRS剪接变异体多肽（例如，SEQID N0:6、9或11)具有结合特异性的结合剂（例如，抗体和其抗原结合片段），或其细胞结合伴 侣之一。在某些实施方案中，所述结合剂为抗体、所述抗体的抗原结合片段、肽、肽模拟物、 小分子或适体。在一些实施方案中，所述结合剂拮抗HRS多肽的非经典活性。在其他实施 方案中，所述结合剂促进HRS多肽的非经典活性。
[0022] 根据本发明的又一个方面，提供了包含生理上可接受的载体和至少一个本文所述 的本发明的分离的多肽、融合蛋白、抗体、分离的多核苷酸、表达载体、宿主细胞等的组合 物，如药物组合物。
[0023] 此外，还包括确定样品中HRS剪接变异体的多核苷酸序列的存在或水平的方法， 所述方法包括使样品接触与SEQID N0:5、8或10所示的HRS剪接变异体特异性杂交的一 种或更多种寡核苷酸，检测样品中寡核苷酸存在与否，并由此确定HRS剪接变异体的多核 苷酸序列的存在或水平。
[0024] 还提供了确定样品中HRS剪接变异体的多核苷酸序列存在或水平的方法，包括使 样品与至少两种特异性扩增SEQIDN0s:5、8或10所示的HRS剪接变异体的寡核苷酸接 触，进行扩增反应，检测扩增产物存在与否，并由此确定HRS剪接变异体的多核苷酸序列的 存在或水平。在一些实施方案中，寡核苷酸与HRS剪接变异体特有的剪接点特异性地结合， 或特异性地扩增所述剪接点。某些实施方案包括将HRS剪接变异体的存在或水平与对照样 品或预定值比较。具体实施方案包括表征样品的状态，使其区分于对照。在具体实施方案 中，所述样品和对照包括细胞或组织，所述方法包括区分不同种类的细胞或组织、不同组织 或器官的细胞、不同细胞发育状态的细胞、不同细胞分化状态的细胞或健康和病变细胞。
[0025] 还包括鉴定与SEQID N0s:6、9或11所示的HRS剪接变异体多肽或一种或更多种 HRS剪接变异体多肽的细胞结合伴侣特异性结合的化合物的方法，其包括a)使HRS多肽或 其细胞结合伴侣或这两者与至少一种测试化合物在适当条件下结合，和b)检测HRS多肽或 其细胞结合伴侣或这两者与所述测试化合物的结合，从而鉴定与HRS多肽或其细胞结合伴 侣或这两者特异性结合的化合物。在某些实施方案中，所述测试化合物为多肽或肽、抗体或 抗体的抗原结合片段、肽模拟物或小分子。在一些实施方案中，测试化合物促进HRS多肽或 其细胞结合伴侣的非经典生物活性。在其他实施方案中，测试化合物拮抗HRS多肽或其细 胞结合伴侣的非经典生物活性。此外，还包括由本文所提供的任意方法所识别的化合物。
[0026] 在其他方面，本发明还提供了通过使细胞或组织与本文所述的本发明组合物接触 而调节细胞活性的方法。例如，在某些实施方案中，待调节的细胞活性选自细胞因子产生、 细胞增殖、凋亡、细胞信号传导、细胞代谢、血管生成、细胞迁移、细胞结合等。在一个具体实 施方案中，所述方法是调节细胞因子产生的方法。在一个更具体的实施方案中，所述方法是 调节IL-2产生和/或分泌的方法。在一些实施方案中，所述方法是调节TNF-a产生和/ 或分泌的方法。在其他实施方案中，所述方法是调节MIPl-a产生和/或分泌的方法。
[0027] 在某些实施方案中，所述细胞活性为细胞因子受体活性。在具体的实施方案中，所 述细胞因子受体是CCR1。在某些实施方案中，所述细胞活性为细胞迁移。一些实施方案包 括减少单核细胞的细胞迁移。在某些实施方案中，所述细胞活性为通过Toll样受体（TLR) 的细胞信号传导。
[0028] 在其他方面，本发明提供了通过给予本发明的组合物而治疗有需要的个体的疾 病、病症或其他状况的方法。举例来说，这类疾病、病症或状况可以包括，但不仅限于，癌症、 炎性疾病、免疫疾病（包括自身免疫疾病）和/或与异常血管生成相关的状况。
[0029] 在某些实施方案中，所述状况是神经系统状况。在具体实施方案中，神经系统状况 与6-羟基多巴胺（6-OHDA)诱导的神经元死亡相关。在某些实施方案中，所述状况是炎性 疾病。在具体的实施方案中，所述炎性疾病是关节炎性痛风或炎性肠疾病。
[0030] 还在其他方面，本发明的多肽、抗体和/或其他组合物实质上可用于本领域内已 知及可用的任何类型的筛选试验。例如，本发明的组合物（例如，多肽、多核苷酸和/或抗 体）实质上可以与任何已知的筛选方法结合使用，以鉴定顺应本发明疗法的合适的细胞类 型和/或疾病状况。在其他实例中，本发明的组合物（例如，多肽、多核苷酸和/或抗体） 可以与已知的筛选方法结合使用，以鉴定直接或间接介导或调节本文组合物的非经典活性 的结合伴侣、竞争性抑制剂和/或其他细胞效应子。例如，在具体的实施例中，提供了鉴定 测试化合物的筛选方法，所述测试化合物作为本发明组合物与所述组合