一种保存外周血中游离dna的保存剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及DNA保存领域，尤其涉及一种保存外周血中游离DNA的保存剂。
【背景技术】
[0002] 目前，外周血中的游离DNA在临床上的应用越来越多，例如无创产前基因检测和 肿瘤诊断都是以外周血中的游离DNA为检测目标。在检测过程中游离DNA的量的多少是一 个关键的指标，如果外周血中有白细胞或者核红细胞破裂，那么基因组DNA将降解进入到 血浆中污染游离DNA，这会严重影响检测结果。所以，在上述检测过程中，外周血都要求在6 个小时之内分离出血浆，低温保存运输，并且保存时间不能过长。
[0003] 因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0004] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种保存外周血中游离DNA的 保存剂，旨在解决现有的血浆游离DNA保存方法保存时间短、保存温度低的问题。
[0005] 本发明的技术方案如下： 一种保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，按质量百分比计，包括： 超纯无菌水 60~80% ; 抗凝剂 5~8% ; 防腐剂 10~25% ; 代谢抑制剂 1~5%; 核酸酶抑制剂0. 5~3%。
[0006] 所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述抗凝剂包括EDTA钾盐、EDTA钠 盐、柠檬酸钠、肝素及枸杞酸钠中的一种或多种组合。
[0007] 所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述防腐剂包括二唑烷基脲、咪 唑烷基脲、1，3-二氯-5, 5-二甲基乙内酰脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、2-溴-2-硝 基-1，3-二醇、恶唑烷、钠羟甲基甘氨酸及金刚烷季铵中的一种或多种组合。
[0008] 所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述代谢抑制剂包括ATA、甘油醛、 磷酸二羟丙酮、甘油醛-3-磷酸、3-磷酸-2-磷酸甘油酸、磷酸、丙酮酸、氟化钠及钾代谢抑 制剂中的一种或多种组合。
[0009] 所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述核酸酶抑制剂硫酸铵、二硫苏 糖醇、0 _巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓醇及二价阳离子的一种或多种组合。
[0010] 所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述二价阳离子为Mg2 +、Mn2 +、Zn2 +、Fe2 +、Ca2 + 或Cu2 +。
[0011] 所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述防腐剂的浓度为50g/L~500g/ L〇
[0012] 所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述防腐剂的浓度为150g/ L~250g/L。
[0013] 所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述保存剂为半固态。
[0014] 所述的保存外周血中游离DNA的保存剂，其中，所述保存剂保存在真空采血管中。
[0015] 有益效果：本发明的保存剂可以保证外周血在常温下保存7天以上，最多可至14 天，常温运输72小时以上，最多可至96小时，并且游离DNA的量在此期间内不会发生明显 变化。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明实施例真空采血管（100yL保存剂）中血液样品0天后的DNA片段 分布图。
[0017] 图2为本发明实施例真空采血管（100yL保存剂）中血液样品3天后的DNA片段 分布图。
[0018] 图3为本发明实施例真空采血管（100yL保存剂）中血液样品7天后的DNA片段 分布图。
[0019] 图4为本发明实施例StreckBCT管中血液样品0天后的DNA片段分布图。
[0020] 图5为本发明实施例StreckBCT管中血液样品7天后的DNA片段分布图。
[0021] 图6为本发明实施例真空采血管（200yL保存剂）中血液样品0天后的DNA片段 分布图。
[0022] 图7为本发明实施例真空采血管（200yL保存剂）中血液样品7天后的DNA片段 分布图。
[0023] 图8为本发明实施例真空采血管（200yL保存剂冲血液样品14天后的DNA片段 分布图。
【具体实施方式】
[0024] 本发明提供一种保存外周血中游离DNA的保存剂，为使本发明的目的、技术方案 及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施 例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0025] 本发明所提供的一种保存外周血中游离DNA的保存剂，按质量百分比计，包括： 超纯无菌水 60~80% ; 抗凝剂 5~8% ; 防腐剂 10~25% ; 代谢抑制剂 1~5% 核酸酶抑制剂0. 5~3%。
[0026] 其中的超纯无菌水，经过灭菌处理的超纯水。
[0027] 进一步，所述抗凝剂包括EDTA钾盐、EDTA钠盐、柠檬酸钠、肝素及枸杞酸钠中的一 种或多种组合。抗凝剂的主要作用为防止血液凝固。
[0028] 进一步，所述防腐剂包括二唑烷基脲、咪唑烷基脲、1，3-二氯-5, 5-二甲基乙内酰 脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基-1，3-二醇、恶唑烷、钠羟甲基甘氨酸及金 刚烷季铵中的一种或多种组合。防腐剂的主要作用是防止血液变质。优选地，所述防腐剂 为二唑烷基脲或咪唑烷基脲。
[0029] 进一步，所述代谢抑制剂包括ATA、甘油醛、磷酸二羟丙酮、甘油醛-3-磷酸、3-磷 酸-2-磷酸甘油酸、磷酸、丙酮酸、氟化钠及钾代谢抑制剂中的一种或多种组合。代谢抑制 剂可以减少游离DNA降解，也减少了细胞裂解，使得细胞DNA不会成为混入到游离DNA中。 优选地，所述代谢抑制剂为ATA、氟化钠、甘油醛和它们的任意组合。更优选地，所述代谢抑 制剂为甘油醛、磷酸二羟丙酮、甘油醛-3-磷酸和它们的任意组合。
[0030] 进一步，所述核酸酶抑制剂为硫酸铵、二硫苏糖醇（DTT)、巯基乙醇、半胱氨 酸、二硫赤藓醇及二价阳离子的一种或多种组合。添加核酸酶抑制剂可防止DNA酶的活 性的降低，影响游离DNA的质量和数量。优选地，所述核酸酶抑制剂硫酸铵，二硫苏糖醇 (DTT)〇
[0031] 进一步，所述二价阳离子为Mg2 +、Mn2 +、Zn2 +、Fe2 +、Ca2 + 或Cu2 +。
[0032] 进一步，所述防腐剂的浓度为50g/L~500g/L。更优选地，进一步，所述防腐剂的浓 度为150g/L~250g/L。所述防腐剂的浓度是应当小于核酸和蛋白交联一起的浓度，该交联 可以用琼脂糖凝胶电泳所指示。
[0033] 进一步，本发明中的保存剂可位于一个专门的设备中，并在采血之前加入。更优 选，该设备是一个抽真空采集容器中，通常是一个管，也可以但不仅仅是真空采血管。所述 保存剂为半固态。其可以是高粘性的，使得其可以有效地作为一种半固态的涂层使用。
[0034] 真空采血管中保存剂的量足以维持细胞形态和防止细胞降解，同时也防止了游离 状态中有害Dnase(核酸酶）活性。当然，核酸酶的活性也可以足够低，使得在样品中的游 离核酸没有实质性稀释。
[0035] 血液样品被吸入到本发明的真空采血管中，至少7天后，游离DNA的存在量，至多 增加约5%。如果无保存液存在，则7天后游离DNA的量会增加至少10倍，甚至达到20倍 以上。游离DNA和细胞DNA混合会减少在血液样品中的任何一种测量游离DNA的量的精确 度。例如，在某种特定癌症的严重程度可通过游离DNA的