一种测序模板的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种测序模板的制备方法。
【背景技术】
[0002]高通量测序模板是测序样品准备中一个至关重要的环节，通过高效的模板制备可以获得高质量的单分子多拷贝测序模板，为下一步测序反应打下基础，乳液PCR是现有的高通量测序平台中最为常用的单分子多拷贝测序模板制备技术之一，因此对基于乳液PCR的模板进行优化有着重大的意义。
[0003]在新一代的高通量测序技术平台中，有多种测序技术都是基于乳液PCR的测序模板制备技术。主要通过在磁性微球上进行高效的乳液PCR扩增:利用乳液PCR的特点，在乳液制备或城中使每个微球反应液滴中只含有一个分子的测序文库和相应的扩增组分，一次来获得高效的单分子多拷贝测序模板微球，为下一步测序过程中获得更好的测序信号和数据提供了保障。现有技术中存在几点问题，首先是乳液体系不稳定，乳液体系若不稳定，不仅降低了乳液扩增成功的几率，同时增加了试验成本，浪费了时间。其次是乳液体系液滴中，单克隆的含量比例较低，增加单克隆比例不但能提高模板的制备效率，同时也能缩短时间，降低成本。最后是磁珠的富集效率较低。所以急需建立一种新的测序模板。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是一种测序模板的制备方法，包括以下步骤:
(1)emPCR扩增混合液的准备；
(2)DNA文库的捕获；
(3)乳化;
(4)emPCR 扩增；
(5)DNA文库微球的富集回收。
[0005]所述乳化过程采用TissueLyser于20Hz破碎4分钟。
[0006]所述乳液PCR的反应体系中包括水相、油相、引发剂、保护剂、表面活性剂与助表面活性剂。
[0007]所述所述水相与油相的体积比为4:9-4:7，优选为8:17。
[0008]所述油相为DC5225C、PGFE, DC193、DC556和矿物油中的I种或几种，优选为DC5225C、DC193 和 DC556。
[0009]所述所述引发剂为过硫酸钠。
[0010]所述所述保护剂为BSA和人血清蛋白中的一种或两种，优选为BSA。
[0011]所述表面活性剂为span80、TritonX-lOO、tween80、tween60 和 tween20 中的一种或几种，优选为span80、TritonX-100、tween80和tween60 ;在微乳液制备时，span80、tween80、tween60 和 tween20 溶于油相，TritonX-100 溶于水相。
[0012]所述表面活性剂占体系的体积比为span80 2.5-5%, TritonX-100 0.4-1.0%，tween80 0.2-0.5%，tween60 0.3-0.5%、tween20 0.2-0.8% ;优选为 span80 2.5-3.5%，TritonX-100 0.7-0.9%, tween80 0.3-0.4%, tween60 0.4_0.5%和 tween20 0.4-0.7%o
[0013]所述助表面活性剂为聚乙二醇和丙三醇中的一种或两种。
[0014]所述水相中包括emPCR助剂、扩增液、引物、DNA聚合酶、dNTP、PPiase (肽脯氨酰顺反异构酶)、!\%(312和水；所述emPCR助剂包括betaine(甜菜碱)、D_ (+) trehalose(右旋海藻糖)、L_carnitine (左旋肉碱)、NP_40 (乙基苯基聚乙二醇)、DTT( 二硫苏糖醇)、formamide(甲酰胺)和DMSO( 二甲基亚砜)中的一种或几种，优选为betaine、D-(+) trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT、formamide 和 DMSO ；占体系的比例为 Betaine 0.4-1.0M, D- (+)trehalose 0.2-0.5M，L-carnitine 0.1-0.4M，NP-40 0.2-0.6%，DTT 1-2.5mM, formamide
0.l-0.2%，DMSO 1-2.5% (其中的百分含量为体积比)。
所述DNA文库磁珠的富集回收时，进行破乳，破乳采用二丁醇或者异丙醇。
[0015]本发明的制备方法操作简单，非常有利于大规模应用。有以下优点:使用的油相、水相表面活性剂以及助表面活性剂使配制的乳液体系非常稳定，乳液扩增的效率高，错配率低，提高了乳液扩增的成功率，降低了实验成本，节省了人力物力成本。乳液体系中，液滴的单克隆比例含量高，单克隆比例的增加显著了提高了乳液扩增的效率。同时，磁性微球的富集效率高。引发剂的选择进一步改善了乳液的乳化效果。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
1.emPCR扩增混合液的准备
(I)配制油相，混合 DC5225C 500 yL、DC193 650 μ L 和 DC556 1200 μ L0
[0017](2)配制水相，加入 1x扩增液 100 μ L 10μΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP 120 μ L PPiase2 μ L MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助剂 350 μ L BSA 12 μ L 双蒸无菌水余量总计 100yL
其中，emPCR 助剂为 Betaine 0.4M，D- (+) trehalose 0.5M，L-carnitine 0.1M，NP-40
0.2%，DTT 2.5mM，DMSO 1%。
[0018]2.DNA文库的捕获
(1)对基因组DNA进行片段化，连接接头，处理后得到单链DNA文库；
(2)将清洗后的微球分装至2mlEP管中；
(3)在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μ L，涡旋震荡10s，得到文库混合液。
[0019]3.乳化
(I)按占体系的体积比，将span80 2.5%、tween80 0.4%、tween20 0.7%和聚乙二醇溶于油相，TritonX-100 0.4%溶于水相，混合。
[0020](2)加入文库混合液和过硫酸钠，置于TissueLyser进行乳化，20Hz破碎4分钟。
[0021]4.emPCR 扩增 (I) PCR 扩增。
[0022]5.DNA文库微球的富集回收 (I)收集乳化液。
[0023]( 2)使用异丙醇清洗微球。
[0024]( 3 )使用KCl清洗微球。
[0025]实施例2
1.emPCR扩增混合液的准备
(I)配制油相，混合 PGPE 450 yL 和 DC556 1300 μ L0
[0026](2)配制水相，加入 1x扩增液 100 μ L ΙΟμΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP 120 μ L PPiase2 μ L MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助剂 350 μ L 人血清蛋白 1yL 双蒸无菌水余量总计 100yL
其中，emPCR 助剂为 Betaine 1.0M, D- (+) trehalose 0.2M，L-carnitine 0.4M，NP-40
0.6%，DTT ImM，DMSO 2.5%。
[0027]2.DNA文库的捕获
(1)使用CaptureBead Wash Buffer TW对磁性微球祸旋震荡，重复两次，5000rpm离心，除去上清；
(2)将清洗后的微球分装至2mlEP管中；
(3)在分装好的EP管中加入稀释后的单链DNA文库10μ L，涡旋震荡10s，得到文库混合液。
[0028]3.乳化
(I)将 span80 3.5%、tween80 0.3%、tween60 0.3% 和丙三醇 0.6 %。溶于油相，TritonX-100 0.7%溶于水相，混合。
[0029](2)加入文库混合液和过硫酸钠，置于TissueLyser进行乳化，20Hz破碎4分钟。
[0030]4.emPCR 扩增 (I) PCR 扩增。
[0031]5.DNA文库微球的富集回收 (I)收集乳化液。
[0032](2)使用异丙醇清洗磁性微球。
[0033](3 )使用NaCl清洗磁性微球。
[0034]实施例3
1.emPCR扩增混合液的准备
(I)配制油相，混合 DC5225C 300 μ L,PGFE 200 yL、DC193 800 yL、DC556 300 μ L 和矿物油400 μ Lo
[0035](2)配制水相，加入 1x扩增液 100 μ L ΙΟμΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP 120 μ L P