一种检测sept9基因甲基化的探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测领域，更具体地，本发明涉及检测SEPT9基因甲基化的探针 及其应用。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是基因表观修饰方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能 关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。哺乳动物中，DNA的甲基 化仅发生于CpG的胞嘧啶上，在DNA甲基化转移酶（DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'端 的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶（mC)。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它可以 调控基因的表达。DNA甲基化是研宄最为深入的表观遗传学机制，其在维持正常细胞功能、 染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。 [0003] 结直肠癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，全球每年新发病例数约为120 万，年病死人数超过60万。发病率仅次于肺癌和乳腺癌，位居恶性肿瘤第3位，病死率居第 4位。近年来，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。WHO统计数据表明，结直肠癌患者的 5年生存率在北美国家约为60%，而我国仅有32%。我国在结直肠癌诊断、治疗水平上，与 发达国家相比还存在较大的差距。研宄认为，5年生存率与诊断时疾病的严重程度具有明显 的相关性，进展期患者的5年生存率不到10%，而早期诊断的结直肠癌患者的5年生存率则 可达90%以上。因此，早发现、早诊断、早治疗对于提高结直肠癌治疗效果具有重大意义。
[0004]S印tin蛋白是一类具有鸟苷三磷酸激酶（GTPase)活性的蛋白家族，在人体内参 与了一系列的重要生理过程，如细胞内物质运输、细胞分裂以及细胞凋亡等。人体内编码 s印tin蛋白的基因共有13种。其中s印tin9基因（SEPT9)位于第17号染色体的17q25 位置，全长219kb，一共有18种不同的剪接产物，可以编码15种多肽。这些变异剪接体的 分布具有组织特异性。最近的研宄结果显示，SEPT9基因的甲基化（尤其是位于SEPT9基 因V2剪接体启动子区CpG岛的甲基化）与结直肠癌的发生和发展密切相关。它可以作为 结直肠癌早期诊断的一个特异性分子标记。因此，检测SEPT9基因的甲基化状态，对结直肠 癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。
[0005] 目前研宄DNA甲基化的方法主要有：1.甲基化敏感性内切酶法；2.重亚硫酸盐 (Bisulfite)修饰法；3.特异性识别甲基化抗体分析法；4.质谱或色谱分析法等。其中重 亚硫酸盐修饰法是目前应用最为广泛的CpG甲基化检测方法。该方法采用Na2S205处理样 本DNA，将未发生甲基化的C转化为U，而发生甲基化的mC保持不变；经过PCR扩增后，U转 变为T，而mC转变为C，从而使基因组上的甲基化/非甲基化转变为C/T(Y)多态性，通过检 测目标位点上的C/T状态，可以确定是否存在基因的甲基化。
[0006] 基于重亚硫酸盐修饰的甲基化检测方法多种多样，比如BSP克隆测序法、荧光PCR 法、芯片杂交法等。其中荧光PCR法和芯片杂交法都需要通过使用甲基化探针来识别目标 位点的甲基化状态。通常情况下，甲基化探针基于完全甲基化的基因序列而设计，即检测区 段内所有的CpG位点都采用G碱基与甲基化的C碱基互补配对，所以只能有效检测完全甲 基化的样品。肿瘤的发生、发展是一个极为复杂的过程，肿瘤细胞具有明显的异质性特征。 不同的肿瘤细胞处在不同的发育阶段，导致肿瘤细胞中SEPT9基因的甲基化程度随发育进 程不断变化。当肿瘤细胞中的SEPT9基因处于部分甲基化状态时，常规探针与模板DNA的 结合效率较低，影响到检测的灵敏度。极端情况下，检测区段中存在1个非甲基化位点，就 可能导致探针与模板DNA无法结合，得到假阴性结果。按常规设计的甲基化探针不适合于 检测SEPT9基因部分甲基化的样本。
[0007] 因此，需要开发新的SEPT9基因甲基化探针及试剂盒，以便更加全面、有效地检测 基因的甲基化状态。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供检测SEPT9基因甲基化的探针及其应用。
[0009] 在本发明的第一方面，提供一种用于检测SEPT9基因甲基化的探针，所述的探针 的核苷酸序列如SEQIDNO:3和SEQIDN0:4所示。
[0010] 在一个优选例中，所述的探针携带有可检测标记物。
[0011] 在另一优选例中，所述的可检测标记物为荧光标记物。
[0012] 在本发明的另一方面，提供一种用于检测SEPT9基因甲基化的试剂盒，所述试剂 盒中包括所述的探针。
[0013] 在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：PCR扩增SEPT9基因的引物；较佳地，所述 引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示。
[0014] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：PCR扩增GAPDH基因的引物，以及特异性 检测GAPDH基因的探针，该探针携带的可检测标记物区别于针对SEPT9基因的探针所携带 的可检测标记物。
[0015] 在另一优选例中，PCR扩增GAPDH基因的引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 14和SEQ IDNO: 15所示；特异性检测GAPDH基因的探针核苷酸序列如SEQIDNO: 16所示。
[0016] 在另一优选例中，特异性检测GAPDH基因的探针的5'端设置JOE荧光标记，3'端 设置BHQ1荧光标记；检测SEPT9基因甲基化的探针的5'端设置FAM，3'端设置BHQ1荧光 记D
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种非诊断性地检测SEPT9基因甲基化的方法，所述 方法包括：以经过重亚硫酸盐处理后的基因样本，采用PCR法、基因芯片法或膜杂交法检测 所述的探针与该基因样本的结合情况，从而获得待测基因样本的SEPT9甲基化情况。
[0018] 在一个优选例中，所述的可检测标记物是荧光标记物，利用SEQIDN0:6和SEQID NO: 7所示的PCR扩增引物以及权利要求1-3任一所述的探针进行荧光PCR法检测，从而获 得SEPT9基因的甲基化情况。
[0019] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0020] 图1、常规探针检测不同甲基化水平样本的荧光扩增曲线。
[0021] 图2、本发明探针检测不同甲基化水平样本的荧光扩增曲线。
[0022] 图3、本发明试剂盒检测SEPT9甲基化阳性样本的扩增曲线。
[0023] 图4、本发明试剂盒检测SEPT9甲基化阴性样本的扩增曲线
【具体实施方式】
[0024] 本发明人经过深入的研宄，揭示了一种优化的检测SEPT9基因甲基化的探针，通 过在探针的特定位置引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基（I)，得到优化的SEPT9甲基化检测探 针，其既能够和完全甲基化的样本DNA结合，又能够容忍结合区段内存在1个非甲基化的位 点，从而有效提尚对不完全甲基化样本的检测效率。
[0025] 如本文所用，"样本"或"样品"需进行DNA甲基化状态检测的核酸物质，其可以来 自于个体（如人或动物），也可以是其它来源的，例如一些经扩增或未经扩增的实验室核酸 材料，或人工合成的测试品。应理解，对"样本"或"样品"的检测并非仅涉及诊断目的，还 可涉及其它非诊断目的。
[0026] 如本文所用，"互补"的序列通常是指将5' -3'方向的序列转换为其3' -5'方向的 序列（如5'ATCG3' 一GCTA)，然后再取其互补序列（如GCTA- 5'CGAT3'）。
[0027] "互补"包括"基本上互补"，所述"基本上互补"是指两段核苷酸的序列是足够互补 的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构（如茎环结构）。通常，两条 "基本上互补"的核苷酸序列互相之间至少有70%的碱基是互补的；优选的，至少有80%的 喊基是互补的；更优选的，至少有90%的喊基是互补的；进一步优选的，至少有95%的喊基 是互补的；如96%、98%。
[0028] 如本文所用，"完全互补"是指两条"互补"的核苷酸序列之间有100%的碱基是互 补的。
[0029] 如本文所用，碱基的"配对"是指两条序列中相应的碱基构成了键（如氢键）的连 接。两条序列中足够多（如多于70%、80%或90%的碱基是配对的）碱基的"配对"使得 两条序列发生互补。
[0030] 本发明基于重亚硫酸盐修饰的甲基化检测方法，DNA样本经过Na2S205处理后，未 发生甲基化的C转化为U，而发生甲基化的mC保持不变，经过PCR扩增后，U转变为T，而mC 转变为C，从而使甲基化/非甲基化转变为C/T(Y)多态性，通过检测甲基化探针与重亚硫酸 盐修饰产物的结合情况，可以明确样本DNA的甲基化状态。
[0031] 本发明的技术方案如下：根据SEPT9基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域序 列，选择一段包含5个CpG位点的区域（5'-TYGGATTTYGYGGTTAAYGYG-3'，其中YG代表CpG 位点）作为甲基化探针结合区；设计两条与目标区段互补的甲基化探针：
【主权项】
1. 一种用于检测SEPT9基因甲基化的探针，其特征在于，所述的探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4 所示。
2. 如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的探针携带有可检测标记物。
3. 如权利要求2所述的探针，其特征在于，所述的可检测标记物为荧光标记物。
4. 一种用于检测SEPT9基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要 求1-3任一所述的探针。
5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：PCR扩增SEPT9基 因的引物；较佳地，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示。
6. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：PCR扩增GAPDH 基因的引物，以及特异性检测GAPDH基因的探针，该探针携带的可检测标记物区别于针对 SEPT9基因的探针所携带的可检测标记物。
7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，PCR扩增GAPDH基因的引物的核苷酸序列 如SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15所示；特异性检测GAPDH基因的探针核苷酸序列如SEQ ID NO: 16 所示。
8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，特异性检测GAPDH基因的探针的5'端设 置JOE荧光标记，3'端设置BHQl荧光标记； 检测SEPT9基因甲基化的探针的5'端设置FAM，3'端设置BHQl荧光标记。
9. 一种非诊断性地检测SEPT9基因甲基化的方法，其特征在于，所述方法包括：以经过 重亚硫酸盐处理后的基因样本，采用PCR法、基因芯片法或膜杂交法检测权利要求1-3任一 所述的探针与该基因样本的结合情况，从而获得待测基因样本的SEPT9甲基化情况。
10. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物是荧光标记物，利用 SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示的PCR扩增引物以及权利要求1-3任一所述的探针进行 荧光PCR法检测，从而获得SEPT9基因的甲基化情况。
【专利摘要】本发明涉及一种检测SEPT9基因甲基化的探针及试剂盒。本发明揭示了一种优化的SEPT9甲基化检测探针，通过在甲基化探针的特定位置引入2-3个脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基(I)，使其既能够和完全甲基化的样本DNA结合，又能够容忍结合区段内存在1个非甲基化的位点，从而有效提高SEPT9基因甲基化的检测效率。该探针结合SEPT9和GAPDH基因扩增引物，可应用于SEPT9基因甲基化检测试剂盒。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104830855
【申请号】CN201510264501
【发明人】王东, 梁旺, 李宾
【申请人】基因科技（上海）有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月21日