Iba1和LAG-3双基因共表达重组腺病毒载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及Ibal和LAG-3双基因共表达重组腺病毒载 体，还涉及该载体的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 脑出血（Intracerebralhemorrhage，ICH)为常见的急性脑血管病，其发病率、病 死率和致残率高，在我国发病率有逐年上升的趋势。ICH后颅内血肿形成是导致神经损伤最 重要的病理。血肿主要成分及红细胞裂解产物诱发的炎症反应、血肿周围代谢异常、局部脑 血流量变化等是导致继发性神经损伤加重的主要原因。目前认为血肿成分激发的炎症反应 在继发性神经损伤中具有重要作用而备受关注。ICH后血肿周围小胶质细胞等炎性细胞激 活，释放TNF-a、IL-1等致炎因子，加之血脑屏障破坏，外周血单核巨噬细胞等炎症细胞向 血肿周边区聚集，由此诱发炎症级联放大反应，最终导致继发性脑损伤和神经功能缺损加 剧。因此，抑制脑出血后小胶质细胞的炎症反应，可以有效控制脑出血后的神经功能损伤。
[0003] 钙离子作为信号转导通道中的第一信使，在所有细胞包括中枢神经细胞的生命 活动中起重要作用。妈离子与不同的妈结合蛋白结合后进行级联反应。Ibal (ionized calcium binding adapter molecule 1)是能与巨细胞和小胶质细胞发生特异性结合的 钙结合蛋白，当这些细胞激活后，Ibal的表达量上调，因此Ibal通常作为鉴定小胶质细胞 的标记物使用。
[0004]淋巴细胞活化基因-3 (lymphocyte activation gene-3, LAG-3, CD223)是免疫球 蛋白超家族的成员之一，是对淋巴细胞具有抑制作用的分子。LAG-3定位于人12号染色体， 与CD4具有密切关系。研宄发现猪LAG-3分子的结构和表达模式在哺乳动物物种中是共有 的，并且可溶性的猪LAG-3对控制人-猪异种T细胞免疫反应有作用。LAG-3分子主要表 达于活化的NK细胞、T淋巴细胞表面，与HLA-II高亲和力结合。肿瘤浸润的CD8+T细胞表 面LAG-3表达上调，LAG-3的抑制作用在HCC的细胞免疫应答中发挥着重要的作用，可见阻 断LAG-3分子的表达有可能成为治疗肿瘤的新方法。此外，使用LAG-3毒性抗体选择性的 靶向激活T细胞可阻碍T细胞参与的迟发型超敏反应。
[0005] 基因联合治疗的方式主要有两种：一是将多种分别携带不同基因的重组表达载体 同时转染靶细胞，这种方式可以自由调节各重组表达载体的比例，但需要分别构建携带不 同基因的重组表达载体，构建工作繁琐、费时，影响因素多；此外，由于转染过程具有一定随 机性，转染后的细胞存在基因拷贝不均一的问题，既不利于目的基因的表达及后续治疗，又 导致实验结果难于评估分析；上述缺点限制了此种方式的进一步应用。二是将两个或两个 以上的基因由一个载体携带表达，这种方式可以通过多启动子载体、多顺反子载体或融合 基因等调控手段提高基因转染效率，增加表达强度，并维持相对的表达比例，从而克服了前 一种方式的不足，近年来日益受到研宄者的重视。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供Ibal和LAG-3双基因共表达重组腺病毒载 体；本发明的目的之二在于提供上述重组腺病毒载体的制备方法；本发明的目的之三在于 提供重组表达腺病毒载体在制备抗小胶质细胞活化的药物中的应用；本发明的目的之四在 于提供利用权重组表达腺病毒载体包装的重组腺病毒；本发明的目的之五在于提供重组腺 病毒在制备抗小胶质细胞活化的药物中的应用。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0008]Ibal和LAG-3双基因共表达重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体含有表达Ibal 和LAG-3的双基因表达盒，所述双基因表达盒依次由CMV启动子、LAG-3基因、内部核糖体 进入位点IRES、Ibal基因和终止子组成，所述LAG-3基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所 示，所述Ibal基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示。
[0009] 优选的，所述重组腺病毒载体是由含LAG-3基因、内部核糖体进入位点IRES和 Ibal基因的片段通过Sal I酶切位点和Not I酶切位点连入pShuttle-CMV载体Sal I 酶切位点和Not I酶切位点之间，然后用Pme I酶切线性化再与pAdEasy-1载体在大肠杆 菌BJ902内同源重组而得。
[0010] 优选的，包括如下步骤：
[0011] a.克隆LAG-3基因和Ibal基因编码区，然后将LAG-3基因编码区插入pStar 载体的IRES上游，再Ibal基因编码区插入pStar载体的IRES下游，得重组载体 pStar-LAG-3-IRES-Ibal；
[0012] b?以重组载体pStar-LAG-3-IRES-Ibal为模板，SEQ IDNo.7和SEQ IDNo.8 所示序列为引物进行PCR扩增，获得带酶切位点的含有含LAG-3基因、内部核糖体进入位 点IRES和Ibal基因的片，然后将含LAG-3基因、内部核糖体进入位点IRES和Ibal基 因的片插入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV的CMV启动子下游，得重组腺病毒穿梭载体 pShuttle-CMV-LAG-3-IRES-Ibal；
[0013]c.将重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-LAG-3-IRES-Ibal与腺病毒骨架载体 pAdEasy-1在大肠杆菌BJ902中进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-LAG-3/Ibal。
[0014] 优选的，步骤a中克隆LAG-3基因的方法如下：提取人肝组织总RNA，逆转录得到 cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示序列为上下游引物进行PCR 扩增，得LAG-3基因；所述PCR条件为94°C预变性5分钟；然后94°C变性50秒，58°C退火 50秒，72 °C延伸2分钟，共30个循环；最后72 °C延伸10分钟。
[0015] 优选的，步骤a中克隆Ibal基因的方法如下：提取人胰腺组织总RNA，逆转录得到 cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQIDNo. 4和SEQIDNo. 5所示序列为上下游引物进行PCR 扩增，得Ibal基因，所述PCR扩增的条件为：94°C预变性5分钟；然后94°C变性50秒，58°C 退火50秒，72 °C延伸2分钟，共30个循环；最后72 °C延伸10分钟。
[0016] 优选的，步骤b中，扩增LAG-3-IRES-Ibal的条件为94°C预变性5分钟；然后94°C 变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。
[0017] 3、所述重组表达腺病毒载体在制备抗小胶质细胞活化的药物中的应用。
[0018] 4、利用所述重组表达腺病毒载体包装的重组腺病毒。
[0019] 5、所述重组腺病毒在制备抗小胶质细胞活化的药物中的应用。
[0020] 本发明的有益效果在于：本发明公开了Ibal和LAG-3双基因共表达重组腺病毒载 体，其含有重组腺病毒载体含有表达Ibal和LAG-3的双基因表达盒，该表达盒可以同时恒 定表达出Ibal和LAG-3蛋白，将重组腺病毒载体包装为重组腺病毒，制成的重组腺病毒体 外转染小胶质细胞后，能够抑制脑出血后的炎症反应，有效提高脑出血小鼠的神经功能，并 延长脑出血小鼠的生存期，可用于制备抗小胶质细胞活化的药物，并在脑血管病的治疗领 域具有良好的开发应用前景。
【附图说明】
[0021] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0022] 图1显示了LAG-3全长cDNAPCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果（1泳道为DNA分子 量标准，2泳道为PCR产物）。
[0023] 图2显示了Ibal全长cDNAPCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果（1泳道为DNA分子 量标准，2泳道为PCR产物）。
[0024] 图3显示了westernblot检测LAG-3和Ibal的表达结果（1为未转染Ad-LAG-3/ Ibal病毒转染小胶质细胞；2为Ad-LAG-3/Ibal病毒转染小胶质细胞）。
[0025] 图4显示了小胶质细胞增殖能力的检测结果。
[0026] 图5显示了小胶质细胞分泌细胞因子能力的检测结果。
[0027] 图6显示了脑出血小鼠的脑水肿情况。
[0028] 图7显示了脑出血小鼠的神经功能评分。
【具体实施方式】
[0029] 下面将结合附图，对本发明的