一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物转化技术领域，尤其涉及一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生 成苷元的方法。
【背景技术】
[0002] 大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次级代谢产物，大豆中天然存在的大豆 异黄酮总共有12种，分为游离型的苷元（Aglycon)和结合型的糖苷（Glycosides)两类，游 离的苷元占总量的2% -3%，包括染料木素（Genistein)、大豆苷元（Daidzein)和黄豆黄 素（Glycitein);糖苷型占总量的97%-98%，主要以葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型和丙 二酰基葡萄糖苷型等形式存在。
[0003] 大豆异黄酮带有2个或3个羟基和芳香环，与人体分泌的雌激素在结构上十分相 似，具有弱雌激素活性，因此大豆异黄酮被称之为天然的植物雌激素。另外，大豆异黄酮还 能有效地预防骨质疏松、乳腺癌、子宫内膜癌，具有抗氧化、抗溶血和抗真菌活性等。经研 宄，大豆异黄酮在大豆中通常以没有活性的糖苷结合形式存在，在人体内只有经肠道菌群 的葡萄糖苷酶分解后，形成游离的大豆异黄酮苷元才具有生物活性。如何有效地将糖苷型 的大豆异黄酮通过水解转化成游离型的苷元以增强大豆异黄酮的生物活性已成为近年来 世界各国科学家研宄的热点。
[0004] e-葡萄糖苷酶（EC3. 2. 1. 21)，又称-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够水解结 合于末端非还原性的0-D-葡萄糖苷键，同时释放出0-D-葡萄糖和相应的配基。1837年， Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现。后来发现该酶在自然界分布广泛，普遍存在于植 物、动物和微生物中。0 -葡萄糖苷酶能将果、蔬、茶中的风味前体物质水解为具有浓郁天 然风味的香气物质，还能协助纤维素酶降解纤维素，已被广泛应用于食品、医药等领域。此 外，食物中黄酮类糖苷在人体吸收过程中包含一个关键的脱糖基作用，它是由小肠上皮中 的0 _葡萄糖苷酶作用下进行的，因此该酶在制备黄酮类活性苷元方面亦显示出极大的应 用前景。
[0005] 灰树花（Grifolafrondosa)，隶属于担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、非裙 菌目、多孔菌科、树花属，又名贝叶多孔菌、千佛菌、莲花菌，日本称"舞茸"，子实体营养丰 富、口味鲜美，是一种珍贵的药、食两用蕈菌，灰树花多糖是其主要的活性成分，具有明显的 抗艾滋病病毒，抗肿瘤、改善免疫系统功能，调节血糖、血脂及胆固醇水平，降血压等作用， 目前市场上开发的灰树花多糖产品，多数是从灰树花子实体里提取的，由于灰树花子实体 的生长周期长，易受气候、环境因素影响，而利用液体深层发酵法可使灰树花生产工业化， 周期缩短，产量增加。作为一种白腐真菌，灰树花具有丰富的水解酶系，目前已发现的有内 切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、0 -葡萄糖苷酶、淀粉酶、漆酶、Mn过氧化物酶等。
[0006] 微生物转化是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进行催化 反应，具有反应条件温和、操作性强、无环境污染等特点，同时微生物培养具有繁殖迅速，生 长周期短，可以降低成本，易于工业化生产。由于大豆异黄酮分子中糖基的连接键是糖 苷键，所以可以利用可分泌葡萄糖苷酶的微生物发酵来实现大豆异黄酮苷元的制备。 目前，曲霉被普遍认为是产葡萄糖苷酶的优良菌种，尤以黑曲霉的效率最高，但仅限于 实验室研制阶段，黑曲霉0 -葡萄糖苷酶的转化效率仍有待提高。
[0007] 因此，有必要探宄一种新的转化大豆异黄酮糖苷生成大豆异黄酮苷元的方法，以 提高苷元的转化效率。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法，该方法获得 的灰树花0 -葡萄糖苷酶的酶活高，产物大豆异黄酮糖苷元的转化率高。
[0009] 一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法，包括：
[0010] (1)将灰树花接入培养基进行发酵培养，获得含灰树花菌丝体的发酵液；
[0011] (2)对发酵液进行匀浆处理，使灰树花菌丝体破碎，葡萄糖苷酶释放到发酵液 中，获得粗酶液；
[0012] (3)将粗酶液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。
[0013] 由于葡萄糖苷酶为胞内酶，需要从菌体中释放出来才能发挥作用，所以对发 酵液进行匀浆处理，即可破碎发酵液中的菌丝体，释放0 _葡萄糖苷酶；释放后无需提取 0 _葡萄糖苷酶即可直接用于大豆异黄酮糖苷的转化，转化后产生的大豆异黄酮苷元，包含 染料木素（Genistein)、大豆苷元（Daidzein)和黄豆黄素（Glycitein)，其中，黄豆黄素的 含量极低，可以忽略。
[0014]作为优选，以重量百分比计，所述培养基包括葡萄糖2~4%，麸皮3~5%，KH2P04 0. 3%，MgS04 0.15%，VBi0.005%，pH5.0,以提高菌株生物量和0-葡萄糖苷酶的酶活。
[0015] 作为优选，所述发酵培养的条件为：20~28°C下培养6~9天。
[0016] 通过实验对粗酶液与大豆异黄酮糖苷的反应条件以及粗酶液中葡萄糖苷 酶与大豆异黄酮糖苷的用量关系进行优选，作为优选，步骤（3)中，反应的温度为40°C~ 60°C。作为优选，步骤（3)中，反应的时间为12~20h。
[0017] 作为优选，以lg大豆异黄酮糖苷计，粗酶液中葡萄糖苷酶的用量为60~70U。
[0018] 发酵培养前，将灰树花接入种子培养基中进行培养，培养条件为：25~28°C下培 养5~8天。
[0019]作为优选，以重量百分比计，所述种子培养基包括马玲薯20 %，葡萄糖2 %，蛋白 胨 1%，KH2P04 0? 3%，MgS04 0? 15%，VB1 0? 005%，pH6. 0。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0021] (1)本发明通过深度发酵灰树花获得大量0 _葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮糖苷制 备苷元，获得的0 _葡萄糖苷酶的活性高，产物转化率高，大大提高了大豆异黄酮的活性及 吸收率，同时转化产物还富含灰树花胞外及菌丝体多糖等生物活性物质，为新型功能物质 的开发及工业化生产奠定基础；
[0022] (2)灰树花液体深层发酵具有繁殖迅速，生长周期短等优点，可以降低成本，易于 工业化生产；
[0023](3)采用灰树花的发酵产物转化大豆异黄酮糖苷，具有反应条件温和，工艺简单、 操作性强、无有机溶剂残留、无环境污染等特点。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步地说明和阐述。
[0025] 本发明选用的菌株为灰树花（Grifolafrondosa)3号，购自河南省农业科学研宄 院。本发明采用的大豆异黄酮提取物为市售产品，该产品中大豆异黄酮的质量分数为40%， 其中大豆苷含量为9. 67%，染料木苷含量为27. 33%。
[0026] 实施例1灰树花液体发酵产0 _葡萄糖苷酶
[0027] 1、0 -葡萄糖苷酶的活力测定方法
[0028] (1)标准曲线的制作
[0029] 准确称取pNP(对-硝基苯酷）13. 90mg，溶解于蒸馏水并定容至100mL。取6个 10mL容量瓶，分别吸取 100、200、300、400、500、60(^14)咿溶液至1-6号瓶，用1111〇1/1似20)3 溶液定容并混匀，1-6号瓶对应的pNP浓度为0. 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06mmol/L，以 蒸馏水为对照测定400nm吸光值并绘制标准曲线。
[0030] (2)样品中0 -葡萄糖苷酶活力的测定
[0031] 取勾衆处理的发酵菌液lmL于离心管中，4°C，lOOOOrpm离心lOmin。取100yL上 清与200yL5mMpNPG混匀，50°C保温30min，加入2mLlmol/L似20)3中止反应并显色，于 400nm下测定吸光值。葡萄糖苷酶酶活力单位（U)定义为，在pH5.0,50°C反应条件下， 一分钟时间内底物被水解释放出1Umol的pNP所需要的酶量。
[0032] 2、种子培养基的制备及其菌种培养
[0033] 种子培养基为马玲薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2P04 0? 3%，MgS04 0? 15%， VB10. 005%，pH6. 0,于121°C灭菌20min;挑取10块左右黄豆大小的固体种子到100mL种 子培养基中，于25°C、180r/min振荡培养7天。
[0034] 3、灰树花液体发酵培养基的制备及其发酵培养产0 -葡萄糖苷酶
[0035] 为了优化灰树花液体发酵产葡萄糖苷酶的发酵培养基，选择葡萄糖和麸皮2 个因素为变量，生物量、胞内多糖及葡萄糖苷酶活力为响应值，其它培养基成分与基础 培养基相同，设计二因素三水平共13个试验点的响应面分析试验，其因素水平选取见表1， 试验方案及结果见表2。
[0036] 表1响应面的因素与水平
【主权项】
1. 一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法，其特征在于，包括： (1) 将灰树花接入培养基进行发酵培养，获得含灰树花菌丝体的发酵液； (2) 对发酵液进行匀浆处理，使灰树花菌丝体破碎，β-葡萄糖苷酶释放到发酵液中， 获得粗酶液； (3) 将粗酶液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，以重量百分比计，所述培养基包括葡萄糖 2 ~4%，麸皮 3 ~5%，KH2PO4 0· 3%，MgSO4 0· 15%，VB1 0· 005%，pH 5. 0。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：20~28°C下培养 6~9天。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，反应的温度为40°C~60°C。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，反应的时间为12~20h。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，以Ig大豆异黄酮糖苷计，粗酶液中β -葡萄 糖苷酶的用量为60~70U。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养前，将灰树花接入种子培养基中进 行培养，培养条件为：25~28°C下培养5~8天。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，以重量百分比计，所述种子培养基包括马玲 薯 20%，葡萄糖 2%，蛋白胨 1%，KH2PO4 0· 3%，MgSO4 0· 15%，VBl 0· 005%，pH 6. 0。
【专利摘要】本发明公开了一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法，该方法包括：将灰树花接入培养基进行发酵培养，获得含灰树花菌丝体的发酵液；对发酵液进行匀浆处理，使灰树花菌丝体破碎，β-葡萄糖苷酶释放到发酵液中，获得粗酶液；将粗酶液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。本发明通过深度发酵灰树花获得大量β-葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮糖苷制备苷元，获得的β-葡萄糖苷酶的活性高，产物转化率高，大大提高了大豆异黄酮的活性及吸收率，同时转化产物还富含灰树花胞外及菌丝体多糖等生物活性物质，为新型功能物质的开发及工业化生产奠定基础。
【IPC分类】C12P17-06, C12R1-645
【公开号】CN104830925
【申请号】CN201510242917
【发明人】何国庆, 杨浣漪, 崔美林
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月13日