L-苏氨酸的分析方法和l-苏氨酸脱氢酶的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2011年3月4日、申请号为201180012376. 9的中国发明申请 "L-苏氨酸的分析方法和L-苏氨酸脱氢酶"的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2010年3月4日提交的日本专利申请2010-48193号的优先权，兹 将其全文援引到本文中。
技术领域
[0004] 本发明涉及L-苏氨酸的分析方法和可用于该分析方法中的L-苏氨酸脱氢酶。
【背景技术】
[0005] L-苏氨酸是必需氨基酸，必须从食物中获取。L-苏氨酸对于保持体内的氣平衡是 必需的，并促进正常的生长发育。此外，它对于保持心血管、肝脏、中枢神经、肠、免疫系统的 功能也有作用。
[0006] 由于缺乏维生素B12、II型瓜氨酸血症、败血症、氨基酸或氮失衡，可导致血液中 的苏氨酸含量不足。此外，素食主义者由于食用缺少苏氨酸含量的谷类，可以导致苏氨酸不 足。对于各种疾病或先天性代谢异常的诊断、患者的长期营养补充、氨基酸代谢异常疾病的 相关研宄等而言，L-苏氨酸的定量是必须的。
[0007] 已报道过多种L-苏氨酸的定量方法。通过四乙酸铅使苏氨酸变为乙醛，用浓聚硫 酸吸收，检测乙醛与对羟基联苯缩合的色素，来测量蛋白质水解产物、明胶、血清中的苏氨 酸，可以通过HPLC、质谱、氨基酸分析装置等定量。这些方法存在操作危险，需要多个步骤， 使用昂贵的仪器，不适合操作多个样品的大规模筛选方法的问题。
[0008] 作为酶学手段，有使用苏氨酸脱氨酶（EC4. 2. 1. 16)的方法。报道了该酶将L-苏 氨酸分解为a-酮基丁酸和氨，所生成的a-酮基丁酸变成腙衍生物的方法（非专利文献 1)〇
[0009] -个例子是用过碘酸氧化大鼠血浆中的苏氨酸，用醛脱氢酶（EC1. 2. 1. 5)定量所 生成的醛。通过添加D-半乳糖消耗多余的过碘酸（非专利文献2)。通过醛脱氢酶的作用， 乙醛还原NAD+，生成NADH+，进一步通过使用荧光色素的方法进行定量。
[0010] 现有技术文献
[0011] 非专利f献
[0012] 非专利文献 1:WatanabeK,ItohN,TanakaA,FukuiS.Applicationofan immobilizedEscherichiacolicelltubeinanalysisofL-threonine.Agric.Biol. Chem. (1982)46:119-126
[0013] 非专利文献2:NishidaT，KumeS，SaitoM，SudaM.Aspecificmethodforthe determinationofthreonineinratbloodplasmausingaldehydedehydrogenase.J Biochem. (1977)81:1085-1090
[0014] 上述非专利文献1和2的全文记载经特别明示援引到本文中。
【发明内容】
[0015] 发明要解决的课题
[0016] 但是，在非专利文献1记载的方法中，苏氨酸脱氨酶不仅对L-苏氨酸有活性，而且 对L-丝氨酸、D-丝氨酸也有活性，因此该方法不适用于定量含有L-丝氨酸的样品。
[0017] 此外，非专利文献2记载的方法必需添加D-半乳糖消化多余的过碘酸，不是借助 单一的酶的定量方法。
[0018] 因此，本发明的目的是提供可以借助单一的酶定量L-苏氨酸的分析方法，提供可 用于该分析方法的新型L-苏氨酸脱氢酶（TDH;EC1. 1. 1. 103)及用于制备该酶的基因等和 酶的制备方法，此外，提供用于上述L-苏氨酸分析的试剂盒、酶制品。
[0019] 尚未报道过使用TDH定量L-苏氨酸。本发明人研宄了适用于L-苏氨酸的分析方 法的新型TDH，结果发现了来自钩虫贪铜菌的新型TDH，并发现使用该TDH的L-苏氨酸的酶 学定量方法是可能的，从而完成了本发明。
[0020]为了解决课题的手段
[0021] 本发明如下。
[0022] [1]、被分析物中包含的L-苏氨酸的分析方法，其中，将含有被分析物的样品与来 源于钩虫贪铜菌（Cupriavidusnecator)的L-苏氨酸脱氢酶或者具有下述（1)-(3)中的 任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质以及辅酶NAD+混合，经过预定的时 间后，分析NADH的量或2-氨基-3-氧代丁酸的量，
[0023] (1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
[0024] (2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1~30个氨 基酸而得到的氨基酸序列；
[0025] (3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸 序列。
[0026][2]、[1]记载的分析方法，其中，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC102504。
[0027] [3]、[1]或[2]记载的分析方法，其中，所述NADH的量的分析是通过测定340nm处 的吸光度（A340)、色素生成、或变换为荧光来进行的。
[0028] [4]、[1]或[2]记载的分析方法，其中，所述2-氨基-3-氧代丁酸的量的分析是 通过将自2-氨基-3-氧代丁酸生成的氨基丙酮用单胺氧化酶氧化，并测定所产生的氨或过 氧化氢来进行的。
[0029][5]、来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶。
[0030] [6]、[5]记载的L-苏氨酸脱氢酶，其中，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC 102504。
[0031] [7]、具有下述（1)_(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白 质：
[0032] (1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
[0033] (2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1~30个氨 基酸而得到的氨基酸序列；
[0034] (3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸 序列。
[0035][8]、来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶，其具有以下物理性质和特性：
[0036] 分子量（SDS-PAGE和凝胶过滤色谱）：79400
[0037] 亚基分子量（SDS-PAGE) : 37200
[0038] 最适pH: 10.0
[0039] 最适温度：75°C
[0040] 底物特异性：仅对L-苏氨酸脱氢酶显示出活性
[0041] 辅酶：NAD+ (对NADP+为非活性）
[0042] 抑制剂：被碘乙酰胺、PMS、NEM抑制。
[0043] [9]、编码[7]记载的蛋白质的基因。
[0044] [10]、重组载体，其是携带了 [9]记载的基因的载体。
[0045] [11]、用[9]记载的基因或[10]记载的重组载体转化宿主细胞而得到的转化体。
[0046][12]、具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质的生产方法，该方法包括在载体上携带 [9]记载的基因，用该载体转化宿主细胞后，培养经转化的宿主细胞从而在培养物中积累由 所述基因编码的蛋白质，收集所积累的蛋白质。
[0047][13]、一种L-苏氨酸分析用试剂盒，其包含下述的（A)或⑶：
[0048] (A)来源于钩虫贪铜菌的L-苏氨酸脱氢酶或者具有下述（1)_(3)中的任一氨基酸 序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的蛋白质，和
[0049] (B)辅酶NAD+ ;
[0050] (1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
[0051] (2)序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1~30个氨基 酸而得到的氨基酸序列；
[0052] (3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸 序列。
[0053] [14]、[13]记载的试剂盒，其中，所述钩虫贪铜菌是钩虫贪铜菌NBRC102504。
[0054] [15]、[13]记载的试剂盒，其还包括用于分析NADH的量的色素和/或酶。
[0055] [16]、L-苏氨酸分析用酶制剂，其是通过使缓冲液中包含来源于钩虫贪铜菌的 L-苏氨酸脱氢酶或具有下述（1)-(3)中的任一氨基酸序列且具有L-苏氨酸脱氢酶活性的 蛋白质而成的：
[0056] (1)序列表的序列号1记载的氨基酸序列；
[0057] (2)在序列表的序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加1~30个氨 基酸而得到的氨基酸序列；
[0058] (3)相对于序列表的序列号1记载的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸 序列。
[0059] [17]、[16]记载