一种与肝癌术后肿瘤复发相关的基因及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因的检测方法，更具体的是涉及一种变异基因的检测方法，属 于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 我国肝细胞癌（HepatocellularCareinoma，HCC，简称肝癌）的发生率位居全球 第一。据统计，全球每年肝癌发病人数约70万人，中国占55%，死亡率占全球45%。现已 发现乙型肝炎病毒OfepatitisBvirus，HBV)与肝癌发病密切相关，尤其在我国约有80% 以上的肝癌与乙肝病毒感染有关。由于我国乙肝相关性肝癌患者就诊时多属中晚期，且多 数伴有肝硬化，手术切除率不足30%，术后复发率高达70 %。肝移植术具有彻底切除肿瘤 的同时又治愈乙肝肝硬化的特点，已成为乙肝相关性肝癌患者唯一的有效治疗手段。但是 肝癌肝移植术后肿瘤的复发转移，导致肝移植受者预后较差，当前尚无有效根治肝癌复发 的方法。术后肿瘤的复发转移极大制约了肝移植治疗肝癌的疗效，造成了肝源浪费。临床研 宄显示肿瘤大小、数目等常见的临床病理特征尚无法精确预测术后肿瘤复发转移。如何降 低乙肝相关性肝癌肝移植术后肿瘤的复发转移已成为我国肝移植临床上亟待解决的难题。
[0003]目前乙肝相关性肝癌肝移植术后肿瘤复发的机制尚不清楚，特别是在肝癌肝移植 术后复发机制中起关键作用的基因变化还不明确。因此，揭示乙肝相关性肝癌肝移植术后 肿瘤复发的关键突变基因，对肝癌肝移植术后复发机制的研宄，解决乙肝相关性肝癌肝移 植后肿瘤复发高危人群的术前筛查、复发预测以及预防复发的个体化靶向治疗的肝移植临 床难题具有重大的意义。
【发明内容】
[0004] 基于上述发明目的，发明人首先发现了一种与乙肝相关性肝癌肝移植术后肿瘤复 发高度相关的，位于人染色体18上的基因MPPE1第chrl8_11897016位点的C/T点突变与乙 肝相关性肝癌肝移植术后肿瘤复发高度相关，进而提供了一种用于非诊断目的的MPPE1基 因点突变的检测方法，所述方法包括鉴定MPPE1基因chrl8_11897016位点是否发生了C/T 点突变。所述chrl8_l1897016位点是指位于人染色体的第11897016位点。
[0005]目前已有多种方法可用于单核苷酸构象多态性（SNP)检测，传统的方法是采用 一些已有的成熟技术，如DNA测序、单链构象多态性（SSCP)、限制性酶切片段长度多态性 (RFLP)、变性梯度凝胶电泳（DGGE)等。新的高通量测定SNP的方法有芯片技术、变性高效 液相色谱OHPLC)、动态等位基因特异的杂交、基质辅助激光解析/电离-飞行时间质朴 (MALDI-T0FMS)技术等。对于上述检测C/T点突变而言，可以使用本领域各种SNP检测的常 规技术手段进行。
[0006] 在一个优选的技术方案中，所述方法包括：
[0007] (1)提取待测样本的DNA;
[0008] (2)以步骤⑴获取的DNA为模板进行PCR扩增；
[0009] (3)鉴定扩增产物在chrl8_11897016位点是否发生了所述C/T点突变。
[0010] 所谓C/T点突变，即该位点的核苷酸序列由野生型C突变为T。
[0011] 优选地，步骤（1)所述待测样本为血液、体液或组织样本。
[0012] 在一个优选的技术方案中，步骤（3)的鉴定采用Sanger测序法。
[0013] 优选地，所述PCR的引物序列分别为SEQIDN0:1和2所示，扩增片段的序列为 SEQIDN0:3所示，所述C/T点突变位于所述SEQIDN0:3的第166位碱基位点。
[0014] 在一个优选的技术方案中，所述方法为PCR-MassArray质谱法。所述方法包括以 下步骤：
[0015] (l)PCR扩增；
[0016] (2)SAP酶处理程序；
[0017] (3)延伸引物单碱基延伸反应；
[0018] (4)纯化；
[0019] (5)芯片点样；
[0020] (6)质谱检测和分析。
[0021] 在一个优选的技术方案中，上述方法所述步骤（1)的PCR扩增的引物序列分别 为SEQIDN0:4和5所示，所述步骤（3)的延伸引物单碱基延伸反应的引物序列由SEQID NO: 6所示，扩增片段的序列为SEQIDNO: 7所示，所述C/T点突变位于所述SEQIDNO: 7的 第49位碱基位点。
[0022] 本发明还提供了一种检测MPPE1基因第chrl8_11897016位点点突变的PCR试剂 盒，所述试剂盒含有PCR反应缓冲液、dNTP、Taq聚合酶，以SEQIDNO: 1和2所示的上下游 引物。
[0023] 本发明还提供了一种用于PCR-MassArray质谱法检测MPPE1基因第 chrl8_11897016位点点突变的试剂盒，所述试剂盒包括：PCR反应缓冲液、dNTP、Taq聚合 酶，以SEQIDN0:4和5所示的上下游引物、SEQIDN0:6所示的的延伸引物、SAP酶、SAP 缓冲液、iPLEX缓冲液、iPLEX终止混合液、iPLEX延伸引物混合液、iPLEX酶、基因芯片。
[0024] 本发明提供的用于非诊断目的的MPPE1基因点突变的检测方法能够快速准确地 鉴定出MPPE1基因chrl8_11897016位点的C/T点突变，可以用于肝癌术后肿瘤复发以及术 前预警复发的评价指标，这对于肝癌肝移植术后复发机制的研宄，解决乙肝相关性肝癌肝 移植后肿瘤复发高危人群的术前筛查、复发预测以及预防复发的个体化靶向治疗的肝移植 临床难题提供重要的参考指标。
【附图说明】
[0025] 图1. PCR-Sanger测序法中靶序列及引物设计位置图；
[0026] 图2.PCR-MassArray法中靶序列及引物设计位置图；
[0027]图 3.PCR-MassArray检测MPPEl/chrl8_l1897016 阴性点突变图谱；
[0028]图 4.PCR-MassArray检测MPPEl/chrl8_l1897016 阳性点突变峰图；
[0029] 图5.MPPEl/chrl8_11897016点突变与肝癌术后肿瘤复发相关性分析图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
[0031] 实施例1.PCR-Sanger测序法对MPPE1基因点突变的检测
[0032] 1.癌组织提取DNA
[0033] 采用QIAampDNAKit试剂盒抽提组织基因组DNA，具体操作：
[0034] ①将研钵、碾柞和匀浆器等器皿洗净，DEPC水冲洗，200°C烘干4h，以去除RNA酶；
[0035] ②高温灭菌后的器皿在室温冷却后加入液氮使用具预冷，将组织从液氮中迅速取 出，切取约50-100mg大小，在研钵中快速研碎；
[0036] ③将研磨好的组织碎末移至预先加入180y1bufferATL中的无RNA酶离心管 中，充分混匀；
[0037] ④加入20yl1.25蛋白酶K，充分混匀。56°C水浴，过夜；
[0038] ⑤取出，快速振荡混匀，加入200y1缓冲液AL，混匀；70°C水浴，lOmin
[0039] ⑥8000rpm离心2分钟，加入200y1无水乙醇，充分混匀。提取上清液，转移至 DNeasy过滤柱上，13000rpm离心3分钟，室温静置1分钟，弃去废液。更换新的收集管。
[0040] ⑦加入500y1缓冲液AW1至过滤柱中，8000rpm离心2分钟，弃去废液。更换新的 收集管。
[0041] ⑧加入500y1缓冲液AW2至过滤柱中13000rpm离心3分钟，弃去管子。
[0042] ⑨将DNeasy过滤柱放置到一个新的1. 5ml离心管上，室温静置3分钟，加入 200y1AE，8000rpm离心2分钟。弃去DNeasy过滤柱。
[0043] ⑩酶标仪测定DNA浓度及纯度0D260/280 (1. 6-1. 8)值；经1 %琼脂糖凝胶电泳观 察有无降解后，于_80°C保存。
[0044] 2.PCR反应
[0045] 所检测的目的基因为MPPE1，其位于人染色体chr18_11897016位点，PCR扩增的引 物序列分别为SEQIDN0:4和5所示，引物在靶序列中的位置如图1所示。使用上述确定 的引物进行PCR扩增。
[0046] 表1.PCR反应体系
[0047]
【主权项】
1. 一种用于非诊断目的的MPPEl基因点突变的检测方法，其特征在于，所述方法包括 鉴定MPPEl基因第chrl8_11897016位点是否发生了 C/T点突变。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 提取待测样本的DNA ; (2) 以步骤⑴获取的DNA为模板进行PCR扩增； (3) 鉴定扩增产物在MPPEl基因第chrl8_11897016位点是否发生了所述C/T点突变。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述的所述待测样本为血液、体 液或组织样本。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3)的鉴定采用PCR-Sanger测序法。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR的引物序列分别为SEQ ID NO: 1 和2所示，扩增片段的序列为SEQ ID NO: 3所示，所述C/T点突变位于所述SEQ ID NO: 3的 第166碱基位点。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤（3)的判读方法为PCR-MassArray质谱 法，所述方法包括以下步骤： (1) PCR 扩增； (2) SAP酶处理程序； (3) 延伸引物单碱基延伸反应； (4) 纯化； (5) 芯片点样； (6) 质谱检测和分析。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)的PCR扩增的引物序列分别 为SEQ ID N0:4和5所示，所述步骤（3)的延伸引物单碱基延伸反应的引物序列由SEQ ID NO:6所示，扩增片段的序列为SEQ ID NO: 7所示，所述C/T点突变位于SEQ ID NO: 7的第 49碱基位点。
8. -种检测MPPEl基因第chrl8_l 1897016位点点突变的PCR试剂盒，所述试剂盒含有 PCR反应缓冲液、dNTP、Taq聚合酶、以SEQ ID NO: 1和2所示的上下游引物。
9. 一种用于PCR-MassArray质谱法检测MPPEl基因第chrl8_11897016位点点突变的 试剂盒，所述试剂盒包括：PCR反应缓冲液、dNTP、Taq聚合酶，以SEQ ID N0:4和5所示的 上下游引物、SEQ ID N0:6所示的的延伸引物、SAP酶、SAP缓冲液、iPLEX缓冲液、iPLEX终 止混合液、iPLEX延伸引物混合液、iPLEX酶、基因芯片。
【专利摘要】本发明公开了一种用于非诊断目的的MPPE1基因点突变的检测方法，所述方法包括鉴定位于人染色体18的MPPE1基因第chr18_11897016位点是否发生了C/T点突变。该方法准确、快速，可以用于非诊断目的的肝癌术后肿瘤复发的评价指标。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104830978
【申请号】CN201510202463
【发明人】张庆, 沈中阳, 陈新国, 陈虹, 尚磊, 王乐天
【申请人】中国人民武装警察部队总医院
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月26日