猪瘟病毒检测引物对的用途及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于猪瘟病毒巢式RT-PCR检测的引物对的用途以及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪瘟病毒（Hogcholeravirus，Swinefevervirus)是猪瘟的病原，危害猪和野 猪。猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出 血、坏死、梗塞。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业重大损失。
[0003] 关于猪瘟检测，2007年，朱小甫等参照GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因 序列，设计并合成引物对，其中扩增采用的引物在E2基因内，建立了猪瘟病毒的PCR检测方 法（朱小甫等2007)。然而该方法建立在具有很大变异性的E2基因内，因而，敏感性和特异 性比较差。
[0004] 另外，国标GB/T 16551 2008中也存在关于猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应方 法。然而该国标中需要得到1200nt大小的基因片段。通常情况下，lOOOnt以上大小的基因 片段，会存在一些问题，例如，与较短基因片段相比，使用较多的试剂，并且耗时。另外，更为 重要的是在扩增时容易产生较多的噪音，从而影响检测结果的准确性或可靠性。
[0005] 综上所述，目前仍然存在以更高的敏感性、特异性以及更高的准确性和可靠性检 测猪瘟病毒的需求。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明的发明人经过深入研宄，发现通过设计针对猪瘟病毒 (CSFV，HEBZ(登录号：⑶592790))序列相对保守区（g卩，P7蛋白）的引物对，并通过巢式 RT-PCR扩增得到较小目标基因片段，能够建立一种猪瘟病毒的RT-PCR快速检测方法，与现 有PCR检测方法相比，具有了更好的敏感性、特异性以及准确性和可靠性。
[0007] 具体地，一方面，本申请提供第一组引物对和第二组引物对在制备通过巢式 RT-PCR检测猪瘟的检测剂中的用途，其中
[0008] 所述第一组引物对为：
[0009] PF1为上游引物，其序列为CGCCACTCAGAITACTTC
[0010] PR1 为下游引物，其序列为TTCCATAACCAGCCCTTT;
[0011] 所述第二组引物对为：
[0012] PF2为上游引物，其序列为GCAITGCTTATGGTTAG
[0013]PR2为下游引物，其序列为AAGTGGGCAGTATGAGG。
[0014] 在另一方面，本申请提供一种猪瘟巢式RT-PCR检测试剂盒，其包括
[0015] 第一组引物对PF1和PR1 :
[0016] PF1为上游引物，其序列为CGCCACTCAGAITACTTC
[0017] PR1为下游引物，其序列为TTCCATAACCAGCCCTTT，和
[0018] 第二组引物对PF2和PR2 :
[0019]PF2为上游引物，其序列为GCAITGCTTATGGTTAG
[0020] PR2 为下游引物，其序列为AAGTGGGCAGTATGAGG。
[0021] 本申请通过运用RT-PCR方法，在对猪瘟病毒的深入了解的基础上，建立了一种新 的猪瘟巢式RT-PCR检测方法，并对其进行了优化，该方法是一种快速、灵敏、便捷的检测猪 瘟病毒的分子生物学方法，与其他检测方法相比较，具有检出率高、特异性强的优点，适合 大面积的猪瘟病毒检测。本方法可实现对CSFV的大规模流行病学调查、隐性感染的检测及 临床诊断，同时，由于巢式RT-PCR检测方法的高敏感性，可以作为CSFV感染早期诊断的最 好方法，从而大幅度提高在猪瘟病毒流行病学调查中的效率，避免由于敏感性低而造成的 误诊，减少对中国养猪业造成的损失。该方法可在县级及其以上动物疫病预防控制中心进 行推广和应用，也为进一步开展中国部分省区的猪瘟病毒流行现状调查工作奠定了基础。
[0022] 通过解释以下本发明的优选实施方案，本发明的其他目的和优点将变得清楚。
【附图说明】
[0023] 图1为PCR检测猪瘟病毒结果。其中M :Marker DL2000 ;1-10为CSFV细胞毒PCR 扩增结果；11为阴性对照。
[0024] 图2CSFVRT-PCR野毒检测方法特异性试验结果。其中M为MarkerDL2000 ;1为 阳性对照；2为CSFV毒株；3为PRV病料；4为PRRSV病料；5为PCV-2病料；6为PPV病料； 7为未接种CSFV的正常细胞培养液。
[0025] 图3CSFVRT-PCR检测方法灵敏度试验结果。其中M:DL2000DNA分子标准；1~ 6依次为106~10 1拷贝/yL梯度稀释PCR结果。
[0026] 图4部分病料中CSFV野毒的检测结果。其中M. DL2000DNA分子标准；1~24为 部分病料PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0027] 除本发明另作说明外，否则本申请中所使用的名词、术语、短语具有本领域内通常 的含义。另外，除本发明另有规定外，否则本申请中所使用的试剂、仪器等均为本领域内的 常规试剂或仪器，并且它们可在市场上自由获得。
[0028] 本申请中所述的"猪瘟病毒"是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，其RNA为单股正 链。其包括多种病毒物种和亚种，例如各种血清型亚种，不同的基因型。另外，还包括毒 力为强、中、弱的各种病毒株，例如：属于的猪瘟病毒弱毒株1. 1亚型的Shimen2004(登录 号：AY775178)，HCLV(登录号：AF091507);属于猪瘟病毒强毒株2. 1亚型的HEBZ(登录号： ⑶592790)，HEB5(登录号：JQ268754)以及SXCDK(登录号：GQ923951)等。
[0029] 本申请所述的"引物"是指具有特定长度的基因片段，例如DNA片段，其能够与 靶基因例如DNA片段的两端通过互补结合。引物的长度没有任何限定，通常为3-50个碱 基，例如5-20,8-15,10-15个碱基长度。优选地，本申请的引物包括第一组引物和第二组 引物。其中第一组引物和第二组引物用于扩增猪瘟病毒基因组中的保守序列，优选地第一 引物用于扩增猪瘟野毒株全基因序列ffiBZ(⑶592790)第3440-4350之间的序列，第二组 引物用于扩增546nt的序列。从特异性和稳定性角度，所述第一组引物对优选为上游引物 PF1:CGCCACTCAGATTACTTC(SEQIDN0.1)，下游引物PR1 为：TTCCATAACCAGCCCITT(SEQID NO. 2)。所述第二组引物对优选上游引物PF2为：GCATTGCTTATGGTTAG(SEQIDNO. 3)，下游 引物PR2为：AAGTGGGCAGTATGAGG(SEQIDNO. 4)。另外，本申请的引物可通过本领域常规的 基因合成技术来合成。
[0030] 优选地，本申请中，引物设计片段主要位于猪瘟病毒P7蛋白的基因组中，部分位 于E2蛋白的基因组中，于其互补结合。优选以下引物作为优选的实例，其中，PF1的TM值 为47. 6, GC含量为50% ;PR1的TM值为52. 5, GC含量为44. 4% ;PF2的TM值为43. 2, GC 含量为41. 2% ;PR2的TM值为47. 5, GC含量为52. 9% ;本申请的引物对不会产生发夹结构 和引物二聚体；经过梯度PCR实验确定，退火最佳温度为55°C。
[0031] 本发明所述的"检测试剂"还可表示为"检测剂"、"诊断试剂"、"诊断剂"等，是指 含有本申请所述引物的任何试剂，例如可为固体试剂，并优选为液体试剂，特别优选适合用 于PCR反应的液体试剂，其中PCR反应的体系可为适用PCR扩增的任何体积的体系，例如， 10yL体系、20yL体系、25yL体系、30yL体系或50yL体系等。
[0032] 在检测试剂为液体的情况下，其中本申请所述引物的浓度可为任何浓度而没有特 别限定，只要其能够配制为适于进行PCR反应的浓度即可。例如，可配制为引物工作浓度的 数倍，例如5倍、10倍、20倍、30倍等。其中引物工作浓度因具体反应体系而不同，通常情况 下为 20pm/yL。
[0033] 本申请中所述的"试剂盒"指含有本申请所述引物或本申请所述检测试剂的任何 包装产品，其中除了所述引物之外，还可包含用于逆转录的试剂例如，逆转录酶。还可包含 用于PCR反应的试剂，例如DNA聚合酶、dNTP混合物和缓冲液等。此外，也可包括用于标识 扩增基因产物大小的DNA Marker等。
[0034] 以下通过具体优选的实例详细描述本发明，然而，本发明并不局限于此。
[0035] 1材料和方法
[0036] 1. 1病料来源
[0037] 组织病料共计400份，来自2010年-2011年北京、河北、河南、湖南、湖北、山东、辽 宁、福建、云南、四川、广西、安徽、浙江共计12个省区的疑似猪瘟发病猪场。猪繁殖与呼吸 综合征病毒（PRRSV)、猪瘟病毒（CSFV)、猪圆环病毒2型（PCV-2)、猪细小病毒（PPV)、猪伪 狂犬病毒（PRV)细胞毒均由中国动物卫生与流行病学中心监测室提供。
[0038] 1.2主要试剂
[0039] TRIzol Regent购自Invitrogen公司，pGEM-T Easy购自Promega公司，AMV反 转录酶、Rnase_Inhibitor、rTaq DNA聚合酶、dNTPsMix、AMV Reverse Transcriptase、DNA Marker DL 2 000等均购自宝生物（大连）工程有限公司。
[0040] 1.3引物的设计
[0041] 根据GenBank收录的CSFV猪瘟野毒株全基因序列HEBZ(⑶592790)，在猪瘟病毒全 基因3440-4350 (P7蛋白）位相对保守的核苷酸之间，设计一对套式PCR引物，扩增的目的 片段为546nt。引物序列如表1所示。引物通过宝生物（大连）工程有限公司来合成。
[0042] 表1猪瘟巢式RT-PCR检测方法引物
[0043]
【主权项】
1. 第一组引物对和第二组引物对在制备通过巢式RT-PCR检测猪瘟的检测剂中的用 途，其中 所述第一组引物对为： PFl为上游引物，其序列为CGCCACTCAGATTACTTC PRl为下游引物，其序列为TTCCATAACCAGCCCTTT ; 所述第二组引物对为： PF2为上游引物，其序列为GCATTGCTTATGGTTAG PR2为下游引物，其序列为AAGTGGGCAGTATGAGG。
2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述猪瘟由猪瘟病毒SXCDK、HEBZ、HEB5或者 Shimen2004 引起。
3. -种猪瘟巢式RT-PCR检测试剂盒，其包括 第一组引物对PFl和PRl : PFl为上游引物，其序列为CGCCACTCAGATTACTTC PRl为下游引物，其序列为TTCCATAACCAGCCCTTT，和 第二组引物对PF2和PR2 : PF2为上游引物，其序列为GCATTGCTTATGGTTAG PR2为下游引物，其序列为AAGTGGGCAGTATGAGG。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述猪瘟由猪瘟病毒SXCDK、HCLV、HEBZ、HEB5 或者Shimen2004引起。
5. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其进一步包括用于猪瘟病毒反转录的试剂和用 于PCR扩增的试剂。
6. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其进一步包括反转录酶和DNA聚合酶。
7. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其进一步包括dNTP混合物。
8. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其中所述第二组引物的目的扩增片段为546nt。
【专利摘要】提供一种猪瘟病毒巢式RT-PCR检测试剂盒。其根据GenBank收录的CSFV猪瘟野毒株全基因序列HEBZ(GU592790)为参照，建立猪瘟病毒PCR监测方法，扩增目的片段为546nt，该方法具有良好的特异性、敏感性和可重复性。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68, C12Q1-70, C12R1-93
【公开号】CN104830994
【申请号】CN201510041607
【发明人】杨若松
【申请人】张家口市动物疫病预防控制中心
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年1月28日