一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法

文档序号:8509097阅读:378来源:国知局
一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业科学技术领域,具体地说是一种鉴定周期短、可靠性高的水稻黑 条矮缩病抗性的分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是被子植物门单子叶植物纲莎草目禾本科稻属植物。水稻是最主要的三大 粮食作物之一,播种面积占粮食播种面积的1/5,年产量约4. 8亿吨,占世界粮食总产量的 1/4,全世界二分之一以上的人口以水稻为主食,同时也是我国最主要的栽培作物之一。水 稻原产亚洲热带,是世界主要粮食作物之一。我国水稻播种面占全国粮食作物的1/4,而 产量则占一半以上,栽培历史已有6000-7000年。水稻为重要粮食作物,除食用颖果外,可 制淀粉、酿酒、制醋,米糠可制糖、榨油、提取糠醛,供工业及医药用,稻杆为良好饲料及造纸 原料和编织材料,谷芽和稻根可供药用,水稻在粮食产业安全、加工制造生产中具有重要地 位。
[0003] 水稻黑条矮缩病是一种由水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarf virus,RBSDV)引起的病毒病,主要以灰飞虱为传播介体进行传播。宿主有杂交水稻、常规 水稻、大麦、小麦、玉米、小米、高粱、看麦娘、早熟禾、罔草、稗草、马塘等28种。近年来,随着 耕作制度和栽培方式的变化、农田生态多样、冬季气候变暖和感病品种的大面积推广,水稻 黑条矮缩病在江苏、浙江、湖南等省大规模发生,迅速成为长江中下游稻区最主要的水稻病 害之一。据统计,2007年水稻黑条矮缩病仅在江苏省局部地区发生,危害面积30. 8万亩,至 2008年已迅速在淮北、沿海和里下河地区蔓延开,全省发病面积上升至400万亩,其中仅病 株率80%以上的绝收田块面积就达3万亩,按平均亩产500公斤初步估算约损失稻谷1. 5 亿公斤,造成了粮食减产、农民减收,给农业生产带来了巨大的损失,同时也严重挫伤了农 民的种粮积极性,也对全国的粮食安全构成极大的威胁。
[0004]目前,对水稻黑条矮缩病的防治主要是使用农药防治传毒介体灰飞虱,但由于介 体昆虫种群数量大,导致防治效果不佳,且存在环境污染。而培育抗病品种是防治各类病害 最为经济、有效的手段。筛选、发掘和创新抗病种质是开展抗病育种的前提和基础,而抗性 基因定位和克隆,则为利用标记辅助选择等分子育种手段,加快和高效培育抗病品种提供 了全新和有利工具。但迄今水稻黑条矮缩病由于其危害严重,可防不可治,且当前生产上推 广的水稻品种大部分不抗病,因而急需培育和改良出水稻黑条矮缩病抗性品种,才能从根 本上减少该病带来的损失。大规模筛选水稻种质资源是培育抗性品种的基础,对候选种质 资源进行抗性鉴定则是重要且必须的措施。
[0005]目前水稻育种上筛选抗病品种、抗病基因定位鉴定抗性家系均采用田间自然发病 鉴定,即将各鉴定品种或品系小区形式种植于大田,每个小区几十株左右,大田常规栽培管 理,传毒介体灰飞虱自然传毒,待水稻显现病症后调查各鉴定品种(家系)小区的穴发病率, 以此为标准鉴别水稻品种(家系)的抗感能力的差异。然而,由于植物对天敌的抗性分为耐 害性、抗生性和排趋性三种类别,各种抗性类别具由不同的抗性机理,水稻也不其外。不同 水稻品种(家系)对灰飞虱排趋性的差异使得不同水稻品种(家系)的某些形态和生理等特 性,表现出对灰飞虱的取食偏向的差异。而水稻黑条矮缩病的传毒介体正为灰飞虱,因此, 通过自然鉴定方法鉴定得到的抗病水稻,可能实际上是抗虫(排趋性强)水稻而并非抗病水 稻。然而,假若以该抗虫不抗病水稻育成品种进行病害区规模种植后,规模种植导致传毒介 体被迫选择而使得水稻对灰飞虱排趋产生的假抗病表现消失,可能给农业生产带来较大的 损失。
[0006] 为排除排趋性对抗病鉴定的影响,定量水稻进行人工定量接种带毒介体成为一种 必然。目前,江苏省农科院周彤等利用人工筛选鉴定的除毒(RSV病毒)灰飞虱进行人工饲 养,在室内条件下以定量带毒灰飞虱在水稻特定生育期接种待测水稻一定时间,培养待测 水稻至发病显症后,根据病害发生的严重度评价待测水稻对水稻黑条矮缩病的抗性水平, 该方法可以克服自然鉴定法中排趋性的干扰,实现了科学准确的水稻抗病的评价。然而,进 行水稻品种资源的抗性鉴定需要大量的传毒介体灰飞虱,人工筛选无毒灰飞虱人工饲养规 模量小,难以满足品种抗性鉴定的规模量的需求,限制了该方法的推广应用。
[0007] 科学技术发展日新月异,用于检验鉴定植物病毒的技术也迅速发展,除了传统的 生物学方法、血清学方法、电子显微镜法、芯片检测法,新兴起的分子生物学方法给植物病 毒的鉴定提供了新方法。分子生物学方法主要是通过提取病毒的核酸(DNA、RNA)来检测病 毒的种类和存在。目前主要应用的定性检测分子生物学方法包括病毒核酸分子杂交技术、 dsRNA电泳技术和多聚酶链式反应(PCR)技术,定量检测主要是指实时荧光定量PCR技术。 此种方法灵敏度高,特异性强,检测速度快,操作过程也比较简便、可用于大量样品检测。荧 光定量PCR在植物病毒检测与鉴定方面,能够定量检测病毒拷贝数。应用荧光定量PCR检 测未知样本时,相比其他定量方法和普通PCR方法特异性更强、准确性高、灵敏度高、线性 关系广、操作简单安全,样品的污染较底(样品的扩增和检测在同一管内进行),且不需要后 期处理。由于荧光定量PCR法对检测未知样品含量的优越性,已经在诸多领域如植物病理 机制研宄,转基因研宄中的目标基因表达水平和医学临床检测方面得到了广泛和成熟的应 用。
[0008] 我们研宄证明对水稻植株接种RBSDV,不管是抗病还是感病水稻植株体内,均检测 到RBSDV病毒,另外水稻植株苗期感染RBSDV病毒之后,症状不凸显,不能确定其抗病性,需 要等到分蘖盛期才能确定其抗病性。令人振奋的是,我们新近研宄发现水稻低氧萌发所产 生的胚芽鞘接种RBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的RBSDV病毒增殖速度与水稻品种抗性直 接相关。胚芽鞘是水稻胚芽外的锥形套状物,是一个鞘状结构,胚芽鞘本来是植物叶片的保 护组织,有保护胚芽中更幼小的叶和生长锥的作用。通常水稻植株感染RBSDV病毒都是在 水稻秧苗期通过灰飞虱传毒的,而种子萌发产生胚芽鞘的传毒研宄被忽略,我们研宄发现 胚芽鞘接种RBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的RBSDV病毒增殖速度与水稻品种抗性直接相 关,我们的研宄发现给水稻黑条矮缩病抗病性的鉴定提供了新思路。
[0009] 本发明通过胚芽鞘培养前期激素的低氧诱导和胚芽鞘培养后期激素的抑制培养 来拓展胚芽鞘的生长时间,而在此时间内通过荧光定量RT-PCR技术对接种病毒后胚芽鞘 内的RBSDV含量进行检测,通过制作RBSDV增殖趋势图实现了接毒后胚芽鞘内RBSDV病毒 增殖速度快速而准确地测量,进而快速鉴定水稻品种对黑条矮缩病的抗性水平和抗性等 级。这一鉴定方法除了可以应用于水稻品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育 外,亦可以应用于抗病基因定位的表型鉴定和抗性遗传规律研宄等众多领域。

【发明内容】

[0010] 本发明的目的是针对现有水稻品种对水稻黑条矮缩病鉴定周期长、鉴定结果不准 确等缺点,提供了一种鉴定周期短、可靠性高的水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法。
[0011] 本发明的目的是通过以下技术方案解决的: 一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法,其特征在于:该鉴定方法包括以下步骤: 1) 选择鉴定标尺:根据人工接毒鉴定中不同品种对水稻黑条矮缩病抗性表现设置高 抗、中抗、感病三个鉴定标尺,选择三个相应水稻品种做为鉴定标尺; 2) 低氧诱导待测水稻和鉴定标尺品种的胚芽鞘:每个品种取15-20粒种子,用0. 6
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