肽及其用图
【专利说明】肽及其用途
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2012年9月7日提交的新加坡专利申请号201206671-8的优先权的 权益，其内容为了所有目的特此通过引用以其全部内容并入。 发明领域
[0003] 本发明一般涉及分子生物学和生物化学领域并特别涉及抗微生物肽与它们的使 用方法及其用途。
[0004] 发明背景
[0005] 抗微生物剂为用于抑制微生物的生长或杀死微生物的剂。多种抗微生物剂诸如抗 生素或抗菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂或抗寄生虫剂为本领域已知的。最常见已知的抗微生物 剂是抗生素，其可应用于医药部门或非医药部门的多种应用。然而，由于在生活的方方面面 中的抗生素滥用，抗生素抗性细菌在增加。微生物，诸如细菌对抗生素的抗性可从基本更大 耐受性或减少的易感性到完全不受抗生素影响的范围。当微生物不能被抗生素或抗细菌剂 控制或杀死时，尽管存在抗生素，微生物能够存活、繁殖并引起对宿主的疾病或损害。此抗 生素抗性微生物成为了显著的公共健康威胁。
[0006] 鉴于以上，需要提供可用于对抗微生物的可选的肽。
[0007] 发明概述
[0008] 在一个方面中，提供了包含式I (SEQ ID NO: 1)的肽：
[0009] [(R)a(X1) b(X2)c(X3)a(X 4)Jn0
[0010] 在一个实例中，X1、X2和X 4彼此独立地选自由K、R、G和A组成的组；X 3为K、R、L、 V、I、G或A。在一个实例中，a和b独立地被选择为从1到10的整数。在一个实例中，c是 选自从0到5的整数。在一个实例中，n是至少1。
[0011] 在另一个方面中，提供了包含式VIII(SEQ ID NO: 27)的肽：
[0012] X7 [RGRK(Xs) (X9) (R)fJn(X10)g0
[0013] 在一个实例中，X7为脂质基团。在一个实例中，X 8和X 9彼此独立地选自由缬氨酸 (V)、异亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、丙氨酸（A)和甘氨酸（G)组成的组。在一个实例中，X ltl选 自由赖氨酸（K)和精氨酸（R)组成的组。在一个实例中，e和f彼此独立地为选自从0到2 的整数。在一个实例中，n是至少1。
[0014] 在另一个方面中，提供了如在本文描述的肽，所述肽用于作为药物使用。
[0015] 在另一个方面中，提供了包含如在本文描述的肽的组合物。
[0016] 在另一个方面中，提供了用于治疗细菌感染或去除细菌的方法。所述方法包括施 用药学上有效量的如在本文描述的肽。
[0017] 在另一个方面中，提供了中和内毒素的方法。所述方法包括施用药学上有效量的 如在本文描述的肽。
[0018] 在另一个方面中，提供了治疗真菌感染或侵扰、或去除真菌的方法。所述方法包括 施用药学上有效量的如在本文描述的肽。
[0019] 在另一个方面中，提供了去除生物膜的方法。所述方法包括施用有效量的如在本 文描述的肽。
[0020] 在另一个方面中，提供了如在本文描述的肽在制造用于治疗细菌感染、或去除细 菌、或中和内毒素、或治疗真菌感染或侵扰、或去除真菌的药物中的用途。
[0021] 在另一个方面中，提供了包含如在本文描述的肽和其说明书的试剂盒。
[0022] 附图简述
[0023] 参考详细描述，同时结合非限制性实例和附图进行考虑，将更好地理解本发明，其 中：
[0024] 图1显示了 C8V2D对抗铜绿假单胞菌（P. aeruginosa)的体外（in vitro)时间-杀 灭动力学（time-kill kinetics)测定的点图。因此，图1显示了本发明的示例性肽在杀灭 微生物中有效。
[0025] 图2显示了局部毒性测试后的角膜的摄影图像。在局部毒性测试中，角膜清晰度 通过裂隙灯显微镜术检查，在应用了 V2D和C8V2D之后每天追踪，持续4天。
[0026] 图3(A)显示了阐明肽的脂质修饰的长度对其有效地中和来自大肠杆菌（E. coli) 的脂多糖的能力的影响的点图。（B)显示了阐明肽的脂质修饰的长度对其有效地中和来自 铜绿假单胞菌的脂多糖的能力的影响的点图。
[0027] 图4显示了显示通过本公开内容的肽和脂质-修饰的肽从脂多糖置换bodipy TR 尸胺（BC)荧光探针的曲线图。图4显示了 BC被本公开内容的脂质修饰的肽有效地置换。 因此，说明了本公开内容的脂质修饰的肽在中和脂多糖中是有效的。
[0028] 图5显示了从对本公开内容的肽和脂质修饰的肽对脂多糖透化的影响的研究中 获得的结果的柱状图。内侧左柱示出了 1.5625(i!g/ml)，向X轴的右手边递增浓度。图5 显示了本公开内容的脂质修饰的肽在诱导脂多糖透化中是有效的。
[0029] 图6显示了本公开内容的脂质修饰的肽在改变金黄色葡萄球菌（S. aureus) DM4001(A)或大肠杆菌ATCC8739(B)的膜电位中的作用。细菌中膜电位的变化以DiSC3-5 的荧光强度的变化中观察，其以每秒计数（c.p.s.)的形式展示。因此，图6显示了，本公开 内容的脂质修饰的肽在引起金黄色葡萄球菌和大肠杆菌两者的膜电位变化中是有效的。
[0030] 图7显示了如通过背光测定所观察的，本公开内容的脂质修饰的肽对金黄色葡萄 球菌内膜的透化程度。图7显示了，本公开内容的脂质修饰的肽C16-V2D有效透化金黄色 葡萄球菌内膜。
[0031] 图8显示了对本公开内容的脂质修饰肽在引起从模拟细菌膜（A)或红血细胞（B) 的脂质体中的钙黄绿素渗漏中的作用的研究的结果。因此，图8显示了本公开内容的脂质 修饰肽选择性引起细菌膜的膜渗漏且不针对哺乳动物红血细胞。
[0032] 图9显示了本公开内容的脂质修饰的肽或脂肽的设计。认为本公开内容的脂质修 饰的肽或脂肽通过静电和疏水相互作用与脂多糖结合。（A)显示了本公开内容的脂质修饰 的肽的实例的结构。（B)显示了脂多糖的结构。（C)显示了本公开内容的脂质修饰的肽与 脂多糖之间的静电或疏水相互作用。
[0033] 图10显示了本公开内容的肽联合第二治疗剂（加替沙星和B2088)对被铜绿假单 胞菌（ATCC 9027)感染的小鼠角膜的体内测试的结果。图10显示了本发明的肽与抗生素 的联合导致对铜绿假单胞菌的有效抑制。
[0034] 图11显示了本公开内容的肽联合第二治疗剂（加替沙星和B2088/99)对被铜绿 假单胞菌（ATCC 9027)感染的小鼠角膜的体内测试的结果。图11显示了本发明的肽与抗 生素的联合提供了导致对铜绿假单胞菌的最有效抑制的协同效应。
[0035] 图12显示了 B2088 (即V2D)和B2088_99 (即G2二聚体）对抗（a)铜绿假单胞菌 ATCC 9027和（B)铜绿假单胞菌ATCC 27853菌株的杀菌性质。注意到B2088_99(即G2二 聚体）减少细菌细胞活力50%的肽的有效剂量（ED5tl)比B2088(即V2二聚体）低两倍。因 此，图12显示了本公开内容的肽对细菌的有效杀灭。
[0036] 图13显示了 B2088 (即V2二聚体）和B2088_99 (即G2二聚体）对抗铜绿假单胞 菌的时间-杀灭动力学。注意到在Ix和2x MIC下B2088_99 (即G2二聚体）表现对两种 铜绿假单胞菌菌株更快的杀灭动力学。因此，图13显示了，本公开内容的肽引起了比对照 更快的杀灭细菌。
[0037] 图14显示了 B2088 (即V2二聚体）和B2088_99 (即G2二聚体）的外膜（OM)渗透 性测定的结果。测量了引起NPN荧光强度50%增加所需的肽浓度（PC5tl)。B2088_99(即G2 二聚体）的PC50比B2088 (即V2二聚体）更高，表明B2088 (即V2D)具有与B2088_99 (即 G2二聚体）相比更高的透化作用。
[0038] 图15显示了 B2088 (即V2二聚体）和B2088_99 (即G2二聚体）与⑷脂多糖 (LPS)和（B)脂质A的相互作用。Bodipy置换测定表明，B2088肽比B2088_99(即G2二聚 体）对LPS的结合强2倍并对脂质A的结合强超过10倍。（C)显示了显示外部添加LPS对 肽的抑制活性的作用的竞争性抑制测定的结果。结果表明，B2088_99(即G2二聚体）可不 具有如B2088(即V2二聚体）的更高的LPS中和作用。这些结果进一步证实了，与B2088 相比，肽B2088_99(即G2二聚体）对LPS弱结合。（D)显示了 Mg2+离子对B2088(即V2二 聚体）和B2088_99(即G2二聚体）的最小抑制浓度值（MIC)的影响。Mg 2+离子使革兰氏 阴性菌的外膜稳定并拮抗阳离子剂的渗透性。图IOT显示了 B2088 (即V2二聚体）对脂质 A和LPS的结合极为依赖于Mg2+浓度。
[0039] 表格简述
[0040] 表1A显示了如通过脂质修饰的V2-二聚体（C2-C14V2D)和V2-二聚体（V2D)的 最小抑制值（MIC)表示的抗微生物活性的比较。表1A显示了脂质修饰的C8-V2-二聚体 与未修饰的V2二聚体肽相比在抑制微生物铜绿假单胞菌、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 (Methici 11 in-resistant Staphylococcus aureus (MRSA))、月市炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的显著改善。
[0041] 表1B显示了脂质修饰的G2-二聚体（C2-C14G2D)和G2-二聚体（G2D)的最小抑 制值的比较。表1B显示了脂质修饰的C8-G2-二聚体和C10-G2-二聚体与未修饰的G2二 聚体肽相比在抑制微生物铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 (MRSA)和肺炎克雷伯氏菌中的显著改善。
[0042] 表2A显示了 V2D、C8-V2D和C10-V2D对抗一系列甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 (MSSA)和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌（MRSA)菌株的抗细菌活性的比较。表2A显示了， 在16株测试的金黄色葡萄球菌之中，C8-V2D二聚体对8个菌株提供了 2倍改善且对1个 菌株提供了 4倍改善。因此，提供了 56. 3%的整体改善。C10-V2D二聚体对10个菌株提供 了 2倍改善。因此，提供了 62. 5%的整体改善。
[0043] 表2B显示了 V2D、C8-V2D和C10-V2D对抗一系列铜绿假单胞菌的抗细菌活性。表 2B显示了，在10株测试的铜绿假单胞菌之中，C8-V2D二聚体对7个菌株提供了 2倍改善且 对1个菌株提供了 4倍改善。因此，提供了 80%的整体改善。C10-V2D二聚体对7个菌株 提供了 2倍改善且对1个菌株提供了 4倍改善。因此，提供了 80%的整体改善。
[0044] 表3A显示了本公开内容的肽和脂质修饰的肽的溶血活性。表3A证明了，本公开 内容的脂质修饰的肽有利地不引起溶血。
[0045] 表3B显示了与V2D相比的C8V2D体外（in vitro)毒性研究的结果。表3B显示 了本公开内容的脂质修饰的肽的实例为体外无毒的。
[0046] 表3C显示了在体内局部和急性毒性测试中C8V2D的安全性浓度。表3C显示，当 局部地应用时,本公开内容的肽在超过3mg/kg耐受；当静脉内应用时，本公开内容的肽在 约6. 25mg/kg耐受；当腹腔内应用时，本公开内容的肽在约100mg/kg耐受。
[0047] 表4A显示了 V2D和脂质修饰的V2D中和50%来自大肠杆菌的脂多糖（LPS)的有 效浓度。表4A显示了本公开内容的脂质修饰的肽在中和来自大肠杆菌的脂多糖中是有效 的。
[0048] 表4B显示了 V2D和脂质修饰的V2D中和50%来自铜绿假单胞菌的脂多糖（LPS) 的有效浓度。表4B显示了本公开内容的脂质修饰的肽在中和来自铜绿假单胞菌的脂多糖 中是有效的。
[0049] 表5显示了 V2D、C6V2D和C8V2D与5种不同抗生素对抗细菌的部分抑制浓度指数 (fractional inhibition concentration index)。表5显不了本公开内容的脂质修饰的 肽的C6-V2二聚体在测试的5个抗生素中的3个抗生素中具有抗铜绿假单胞菌的更好协同 作用。与C6-V2二聚体相比，C8-V2二聚体具有抗铜绿假单胞菌的更弱作用。与之相比，当 针对大肠杆菌测试时，本公开内容的脂质修饰的肽的C8-V2二聚体比未脂质修饰的肽具有 好得多的协同作用。
[0050] 表6显示了 B2088 (即V2D)和B2088_99 (即G2D)的最小抑制浓度（MIC)。
[0051] 表7显示了如通过6050(杀死50%