用于floury(fl2)性状基因渗入的玉米中的floury 2基因特异性测定法
【专利说明】用于FLOURY(FL2)性状基因渗入的玉米中的FLOURY2基因 特异性测定法
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请主张35U.S.C. § 119(e)下的2012年5月30日提交的美国临时申请系列 号第61/653, 287号的优先权，其公开内容通过全文引用并入本文。
[0003] 通过提及并入电子提交的材料
[0004] 因此与本文同时提交并且标示如下：1个28, 672字节ASCII(文本）文件、名称为 "225450_SEQ_LISTING_ST25.txt"、创建于2013年5月28日的计算机可读的序列表，通过 全文引用并入本文。 发明领域
[0005] 本发明公开一般涉及植物育种。提供了用于测定fl2突变的存在和植物在此突变 上的接合性的方法。本发明公开的方法可用于选择携带floury2(fl2)性状的植物及fl2 性状对植物诸如玉米的基因渗入。
[0006] 发明背景
[0007] 玉米青贮饲料由于其高能量和可消化性而成为反刍动物的一种常用草料。经常将 玉米谷物添加到定量给粮（ration)配方以改善营养平衡。谷粒硬度和质地在淀粉可消化 性中发挥重要的作用。较软的谷粒或在其不太成熟时收获的杂种更容易在瘤胃中消化。天 然存在的玉米突变，诸如褐色中脉（brownmidrib) (BMR)、floury2(fl2)、和opaque2 (02) 由于它们与较软的谷粒中脉相关已成为青贮饲料产品开发的焦点。例如，BMR种质降低了细 胞壁木质素含量。Cherney等（1991)Adv.Agron. 46:157-98。具有fl2或02突变的植物生 成软的，具有不规则形状的蛋白质体和比野生型更高的赖氨酸含量的淀粉质乳胚。Coleman 等（1997)PNAS94:7094-97。将具有fl2或02突变的谷物添加到定量给粮可以提高反刍动 物的消化性，降低了营养要求所需的谷物量并降低收获时谷粒加工的需要。参见Ladely等 (1995)J.Anim.Sci. 73:228-235。
[0008] 据报告，floury2性状与玉米醇溶蛋白基因家族（玉米种子中主要的醇溶谷蛋白 贮存蛋白）的成员之一中的突变有关。Song等（200DGen.Res.il: 1817-25。fl2突变对玉 米系中的基因渗入是一个费时的过程。由于fl2突变体等位基因是半显性的，基于谷粒透 明状态（vitreousness)的表型分型是困难的且经常是不明确的。Coleman等（1997)。需要 一种快速的，基因特异性的分子测定法来检测fl2突变体等位基因，并测定候选植物中的 接合性。此测定法会通过缩短选择具有期望特征的植物需要的时间而大大促进育种工作。
[0009] 发明概述
[0010] 本文中描述了用于fl〇ury2玉米品种（例如f!2突变体）的基于PCR的高通量分 子表征的方法，其可以大大增强含有fl2的玉米系的基因渗入的育种方法。本发明公开了 通过测定f!2突变体和野生型alpha-玉米醇溶蛋白等位基因的存在或缺乏而用于测定植 物组织样品及由此制备该样品的植物的接合性的方法。因此，提供了基于PCR的荧光探针 接合性测定法（在本文中称为KASPar?测定法），其特异性检测并测试f12基因座处的接 合性状态，并且能够分辨分离群体间基因中的独特SNP变体。还公开了包含此独特SNP的 核苷酸序列，和使用这些方法选择的植物和种质。
[0011] 在一个特定的实施方案中，使用玉米植物组织测定等位基因的接合性和/或存在 /缺乏的方法包括：从所述玉米植物组织获得分离的基因组DNA的样品；使所述分离的基因 组DNA与至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQIDNO:9杂交的核苷酸序列的核酸分 子和至少一种能够在高严格性条件下与SEQIDN0:10杂交的核酸分子接触；并测定所述分 离的基因组DNA中fl2突变的接合性。
[0012] 在另一个实施方案中，用于将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物 种质中的方法包括：将在f12基因中具有突变的植物与另一个植物杂交；从通过所述杂交 生成的后代植物获得分离的基因组DNA的样品；使所述分离的核酸与至少一种具有核苷酸 序列的核酸分子接触，所述核苷酸序列能够在高严格性条件下与SEQIDNO: 10杂交；并如 下选择在所述fl2基因中包含突变的来自所述杂交的后代，即繁殖获得在高严格性情况下 结合所述至少一种核酸分子的样品的植物，由此生成遗传工程化植物，其中高赖氨酸含量 的性状已经基因渗入所述遗传工程化植物的种质中。
[0013] 附图简述
[0014] 图1显示了来自野生型玉米系B73(B73)、野生型玉米系1(NF7_3)、L3430(其 是公开可获得的fl〇ury2玉米系I(L3430))、floury2玉米系2 (FF1_1)、floury2玉米系 3 (FF2_1)的22kDaa-玉米醇溶蛋白基因组序列的比对。鉴定出72个SNP和7个插入缺失 (InDel)〇
[0015] 图 2 显示了来自B73、野生型玉米系l(NF7_3)、floury2 玉米系l(L3430)、floury2 玉米系2(FF1_1)和floury2玉米系3(FF2_1)的预测22-kDaa-玉米醇溶蛋白蛋白质序列 的比对。亮色字体标示-1信号肽处的A至V取代。
[0016] 图3显示了基于在-1信号肽上丙氨酸至缬氨酸取代用KASPar?测定法测定基 因型的23个玉米近交系的KUMS数据分析（突变体等位基因的FAM信号作为X-轴和野生 型等位基因的CAL信号作为y-轴）。
[0017] 图4显示了基于在第39个氨基酸处的丙氨酸至缬氨酸取代用KASPar?测定法 测定基因型的23个玉米近交系的KUMS数据分析（突变体等位基因的FAM信号作为X-轴 和野生型等位基因的CAL信号作为y-轴）。
[0018] 图5显示了用玉米近交系进行的确认测试，所述玉米近交系基于在第39个氨基酸 处的丙氨酸至缬氨酸取代用KASPar?测定法测定基因型（突变体等位基因的FAM信号作 为X-轴和野生型等位基因的CAL信号作为y-轴）。
[0019] 图6显示了用分离群体进行的验证测试，所述分离群体基于在第39个氨基酸处的 丙氨酸至缬氨酸取代用KASPar?测定法（fl2_zyg〇)测定基因型（突变体等位基因的FAM 信号作为X-轴和野生型等位基因的CAL信号作为y-轴）。
[0020] 序列表
[0021] 所附序列表中所列的核酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写显示，如37C. F.R. § 1. 822中显示的。仅显示每个核酸序列的一条链，但是互补链理解为通过对展示链的 任何引用而包括在内。在所附序列表中：
[0022]SEQIDNO: 1显示了用于扩增22kDaB73a-玉米醇溶蛋白基因的正向引物序列 (玉米醇溶蛋白 _68F) :GAGATCATGCATGTCAITCCA。
[0023] SEQIDNO:2显示了用于扩增22kDa B73a-玉米醇溶蛋白基因的反向引物序列 (玉米醇溶蛋白 _68R) :ITGGTGITGTTAAGITCACATGC。
[0024] SEQ IDNO:3显示了用于测序B73a-玉米醇溶蛋白部分基因的来自a-玉米醇溶 蛋白基因的寡核苷酸序列（玉米醇溶蛋S_513F) :AATCCTTGGCACATCTAA。
[0025] SEQ IDN0:4显示了用于测序B73a-玉米醇溶蛋白部分基因的来自a-玉米醇溶 蛋白基因的寡核苷酸序列（玉米醇溶蛋白-23R) !TAGGTGGCTCAGTGATGGCAGAA。
[0026] SEQIDNO:5显示了用于测序B73a-玉米醇溶蛋白部分基因的来自a-玉米醇溶 蛋白基因的寡核苷酸序列（385_R)CTAAAAGATGGCACCTCCAA。
[0027]SEQIDNO:6显示了等位基因特异性引物序列（Al)。
[0028]SEQIDNO:7显示了等位基因特异性引物序列（A2)。
[0029] SEQIDN0:8显示了共同（反向）引物序列（Cl)。
[0030]SEQIDN0:9显示了来自植物系B73的22kDaa-玉米醇溶蛋白基因的核苷酸序 列。
[0031] 3￡〇10勵：10显示了来自植物系1^34340的221^)&€[-玉米醇溶蛋白基因的核苷酸 序列。
[0032]SEQIDN0:11显示了来自植物系FF2_1的22kDaa-玉米醇溶蛋白基因的核苷酸 序列。
[0033]SEQIDN0:12显示了来自植物系FF1_1的22kDaa-玉米醇溶蛋白基因的核苷酸 序列。
[0034]SEQIDN0:13显示了来自植物系NF7_3的22kDaa-玉米醇溶蛋白基因的核苷酸 序列。
[0035]SEQ ID NO: 14显示了来自植物系B73的a-玉米醇溶蛋白基因的预测氨基酸序 列。
[0036]SEQIDN