用于标靶核酸富集的组合物、方法、系统和试剂盒的制作方法
【专利说明】
[0001]相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求2012年10月15日提交的美国临时申请 第61/714, 206号和2013年2月13日提交的标题是"用于标靶核酸富集的组合物、方法、 系统和试剂盒（COMPOSITIONS,METHODS,SYSTEMSANDKITSFORTARGETNUCLEICACID ENRICHMENT) "的美国临时申请第61/764, 122号的优先权益，所述临时申请的公开内容以 全文引用的方式并入本文中。
技术领域
[0003] 本文中提供用于使标靶核酸分子从样品富集的方法、试剂盒、组合物和设备。还提 供用于从样品分离核酸分子的方法、试剂盒、组合物和设备。本发明大体上涉及用于使核酸 分子正规化的方法、试剂盒、组合物和设备。
【背景技术】
[0004] 在下游应用（例如克隆和核酸测序）之前，经常需要包括使标靶核酸分子从样品 或反应混合物富集的样品制备。典型地，此类下游应用以高通量形式执行，增加用于在此类 技术之前的样品制备的劳动、时间和试剂成本。此类应用经常需要核酸分子样品输入的起 始量和/或浓度在最优工作范围内正规化（或标准化）。举例来说，许多应用需要在分析可 以执行之前使核酸样品正规化，此类正规化的目的是使每个样品内的核酸分子的数目（或 核酸分子的浓度）与彼此实质上相等。这些定量和正规化步骤极其耗时并且冗长；并且滥 用实验室资源，因为待定量和/或正规化的标靶核酸库的数目增加。典型地，为了定量标靶 核酸库，稀释每个样品的等分试样，并且测定核酸浓度。如果任一个或两个样品的浓度与可 接受的工作范围显著不同，那么可以将样品稀释或以其它方式调节到可接受的起始量或浓 度。在一些情况下，在正规化过程期间将核酸浓度调节为与彼此实质上相等。此过程称为 "正规化"，导致产生具有实质上相等数目（或浓度）的核酸分子的正规化样品。此类定量 和/或正规化过程，除了是劳动密集的之外，还妨碍其它下游过程可以开始的速度。在一些 情况下，定量并且正规化数千个标靶核酸库所需的时间可以最终影响测序数据可以由此类 下游过程获得的速度。因此，需要的是一种改进的使一个或多个样品内的核酸分子的起始 数目和/或浓度正规化的方法。还需要的是一种从引物延伸反应混合物纯化延伸的引物产 物的方法。此外，需要一种用于从样品分离特定量的核酸的方法。
【附图说明】
[0005] 并入到说明书中并且形成说明书的一部分的随附图式说明一个或多个例示性实 施例并且用以解释各个例示性实施例的原理。图式仅是例示性并且解释性的，并且不应理 解为以任何方式限制或约束。
[0006] 图1是描绘标靶核酸分子富集方法的非限制性实施例的示意图。
[0007] 图2是描绘使用标靶核酸分子富集方法的非限制性实施例获得的例示性结果的 示意图。
[0008] 图3是描绘使用标靶核酸分子富集方法的非限制性实施例获得的例示性结果的 示意图。
[0009] 图4是描绘使用标靶核酸分子富集方法的非限制性实施例获得的例示性结果的 示意图。
[0010] 图5是描绘使用标靶核酸分子富集方法的非限制性实施例获得的例示性结果的 示意图。
【具体实施方式】
[0011] 本文中提供用于使标靶核酸分子从样品富集的方法、试剂盒、组合物、系统和设 备。在一些实施例中，本发明大体上涉及一种用于使反应物中的一种或多种标靶核酸分子 的浓度正规化的方法，其包含：通过使包括一群标靶核酸分子的样品与固定并且有限量的 捕获寡核苷酸在其中所述捕获寡核苷酸与所述标靶核酸分子中的至少一些杂交的条件下 接触，来产生一群结合的标靶核酸分子；和通过捕获相当大部分的所述结合的标靶核酸分 子群体，来形成一群捕获的标靶核酸分子，其中捕获的标靶核酸分子的数目与捕获寡核苷 酸的所述固定并且有限量成正比。在一些实施例中，所述用于使一种或多种标靶核酸分子 的浓度正规化的方法包括引物，所述引物具有由不可复制部分间隔开的第一引物序列和第 二引物序列；捕获寡核苷酸；和结合剂。在一些实施例中，所述方法、试剂盒、组合物和设备 可以用以正规化宽输入范围的核酸分子，使得富集的核酸分子的数目与捕获寡核苷酸的数 目成正比。在一些实施例中，本发明涉及使标靶核酸富集的方法，其通过消除当前富集方法 中所存在的一个或多个清除步骤、洗涤和/或萃取步骤来进行。
[0012] 在一些实施例中，本发明涉及一种简单、快速、流线型的从样品反应物或混合物分 离标靶核酸的方法，其包含通过使包括一群标靶核酸分子的样品与固定并且限制量的捕获 寡核苷酸在其中所述捕获寡核苷酸与所述标靶核酸分子中的至少一些杂交的条件下接 触，来产生一群结合的标靶核酸分子；和通过捕获相当大部分的所述结合的标靶核酸分子 群体，来形成一群捕获的标靶核酸分子，其中捕获的标靶核酸分子的数目与捕获寡核苷酸 的所述固定并且限制量成正比。
[0013] 在一些实施例中，本发明涉及一种试剂盒，其包含引物，所述引物具有第一引物序 列和第二引物序列，任选地具有间隔开所述第一引物序列与所述第二引物序列的不可复制 部分；捕获寡核苷酸；和结合剂。在一些实施例中，所述引物包括第一引物序列和第二引物 序列，其中所述第一引物序列与第二引物序列由间隔子或聚乙二醇间隔开。在一些实施例 中，所述第一引物序列与所述捕获寡核苷酸的至少一部分实质上互补，使得所述第一引物 序列与所述捕获寡核苷酸杂交。在一些实施例中，所述第一引物序列与所述捕获寡核苷酸 互补。在一些实施例中，所述第一引物序列和第二引物序列在第一解链温度下与彼此实质 上互补。在另一个实施例中，所述第一引物序列和第二引物序列在第二解链温度下与彼此 实质上互补但不与彼此杂交。在一些实施例中，所述第一引物序列在所述第二解链温度下 与所述捕获寡核苷酸杂交。
[0014] 在一些实施例中，所述捕获寡核苷酸与所述具有不可复制部分的引物和/或所述 结合剂相比以限制浓度提供。在一些实施例中，所述结合剂和具有不可复制部分的引物以 比所述反应物中所存在的捕获寡核苷酸的量多约10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %或的量存在。在一些实施例中，所述捕获寡核苷酸以有限浓度存在于所述反应物 中，由此驱动所述捕获寡核苷酸与所述一种或多种待富集的标靶核酸分子杂交。
[0015] 在一些实施例中，本发明大体上涉及一种引物延伸反应混合物纯化引物延伸产物 的方法，其包含使引物与模板核酸杂交，其中所述引物包括由不可复制部分间隔开的第一 引物序列和第二引物序列，并且其中所述第一和第二引物序列与彼此实质上互补并且具有 第一解链温度；使所述引物以模板依赖性方式延伸以形成引物延伸产物，其具有包括所述 第一引物序列的单链区；使所述引物延伸产物与捕获寡核苷酸杂交，所述捕获寡核苷酸包 括捕获部分；和使用结合剂选择性捕获所述引物延伸产物，所述结合剂与所述捕获部分选 择性结合。在一些实施例中，所述引物包括发夹、茎环或分叉引物。在一些实施例中，所述 引物包括一个或多个不可复制部分。在一些实施例中，所述延伸的引物产物可以包括天然 存在的核苷酸、核苷酸类似物或经标记的核苷酸。在一些实施例中，所述捕获寡核苷酸以限 速浓度存在。在一些实施例中，所述结合剂与所述捕获寡核苷酸相比以过量至少2倍存在。 在一些实施例中，所述引物在所述第一解链温度下主要以二级结构形式存在于所述反应物 中，由此抑制所述第一引物序列与所述捕获寡核苷酸杂交。在一些实施例中，所述二级结构 包括发夹或茎环结构。在一些实施例中，所述引物在所述第二解链温度下主要以线性结构 形式存在于所述反应物中，由此使得所述第一引物序列能够与所述捕获寡核苷酸杂交。在 一些实施例中，所述捕获寡核苷酸以限速浓度存在于所述反应物中。在一些实施例中，所述 引物和所述结合剂两者与所述捕获寡核苷酸相比都以过量至少2倍存在于所述反应物中。
[0016] 在一些实施例中，本发明大体上涉及一种组合物，其包含引物，所述引物具有任选 地由不可复制部分与彼此间隔开的第一引物序列和第二引物序列。在一些实施例中，所述 组合物包括引物，所述引物具有在第一解链温度下与彼此实质上互补或互补的第一引物序 列和第二引物序列。在一些实施例中，所述组合物包括引物，所述引物具有在第二解链温度 下不与彼此实质上互补的第一引物序列和第二引物序列。在一些实施例中，所述组合物包 括引物，所述引物具有在第二解链温度下与捕获寡核苷酸实质上互补或互补的第一引物序 列。在一些实施例中，所述捕获寡核苷酸进一步包括与结合剂结合的捕获部分。
[0017] 在一些实施例中，本发明大体上涉及用于使一种或多种标靶核酸从样品富集的试 剂盒（以及相关方法、组合物、设备），其包含引物，所述引物具有第一引物序列和第二引物 序列；捕获寡核苷酸；和结合剂。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括引物，所述引物 具有一个或多个间隔开所述第一引物序列与所述第二引物序列的不可复制部分。在一些实 施例中，所述试剂盒进一步包括限速浓度的捕获寡核苷酸。在一些实施例中，所述捕获寡核 苷酸进一步包括能够与结合剂结合的捕获部分。在一些实施例中，所述结合剂和捕获部分 可以是本领域普通技术人员已知的任何适合结合剂或捕获部分。举例来说，所述结合剂和 捕获部分可以包括抗生蛋白链菌素和生物素。在一些实施例中，所述试剂盒任选地包括一 个或多个条形码。在一些实施例中，所述一个或多个条形码可以用以索引一种反应物中的 多种核酸样品。
[0018] 可以受益于使用本文中所公开的标靶富集方法和正规化方法的一种具体例示性 应用是核酸测序，包括下一代测序（NGS)。许多包括离子激流测序仪（PersonalGenome Machine?和IonTorrentProton?测序仪（生命技术（LifeTechnologies),加利福尼亚 州（CA)))的NGS平台需要提前制备大量的待测序的标靶核酸分子并且使其富集。关于Ion TorrentPGM?测序仪的组合物、设计和操作的其它细节可以见于例如现以美国专利公开第 2009/0026082号公布的美国专利申请第12/002781号、现以美国专利公开第2010/0137143 号公布的美国专利申请第12/474897号和现以美国专利公开第2010/0282617号公布的 美国专利申请第12/492844号中，所述申请全部以全文引用的方式并入本文中。NGS领 域内存在多种库制备方法和试剂盒，其允许从单一来源制备多种标靶核酸分子（Ion Ampliseq?库制备，公开部件号：MAN0006735或IonXpress?加gDNA片段库制备，公开部 件号4471989(生命技术，加利福尼亚州）；用于离子激流的NEBNEXT?快速DNA库制备 套件，新英格兰生物实验室（NewEnglandBiolabs)目录编号E6270L)。条形码的出现已经 通过允许在单一测序回合中从多个样品或来源索引多种标靶核酸分子而扩展此功能（Ion Xpress?条形码衔接子1-96,用于IonXpress?加片段库试剂盒（生命技术，加利福尼亚 州）；AccessArray?条形码库，富鲁达公司（FluidigmCorp)，加利福尼亚州）。NGS的一 些领域，例如靶向重测序典型地利用许多例如在数个96孔板中平行制备的样品。使用已知 库制备方法制备的带条形码的与不带条形码的核酸库的起始量大幅变化，并且因此必须在 过渡到下游过程中之前个别地定量。标靶核酸库的定量可以使用多种方案来实现，所述方 案包括qPCR、Qubit?荧光计（生命技术，加利福尼亚州）和Bioanalyzer?(安捷伦技术 (AgilentTechnologies),加利福尼亚州）。
[0019] 本文中所用的章节标题仅用于组织目的并且不应理解为以任何方式限制所描述 的主题。
[0020] 本申请中引用的所有文献和类似材料（包括但不限于专利、专利申请、文章、书 籍、论文和因特网网页）明确以全文引用的方式并入用于任何目的。当并入的参考文献中 的术语的定义呈现为与本发明教示中提供的定义不同时，应以本发明教示中提供的定义为 准。
[0021] 应了解，在本发明教示中论述的温度、浓度、时间等之前存在暗示的"约"，使得微 小并且非实质的偏差在本文中本发明教示的范围内。
[0022] 除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
[0023] "包含"、"包含了"、"包含着"、"含有"、"含有了"、"含有着"、"包括"、"包括了"和"包 括着"的使用并不打算具限制性。
[0024] 应理解，以上一般描述和以下详细描述两者仅是例示性和解释性的并且并不限制 本发明。
[0025] 除非另外定义，否则结合本文中所述的本发明教示使用的科学和技术术语应具有 本领域普通技术人员通常理解的含义。一般来说，本文中所述的与细胞和组织培养、分子生 物学以及蛋白质和寡核苷酸或聚核苷酸化学和杂交结合使用的命名法和其技术是本领域 中所熟知并且常用的命名法和技术。标准技术用于例如核酸纯化和制备、化学分析、重组 核酸和寡核苷酸合成。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域中通常所实 现或如本文中所述来执行。本文中所述的技术和程序通常根据本领域中所熟知以及如本发 明的说明书通篇中所引用和论述的各个一般性和较特定的参考文献中所述的常规方法来 执行。参看例如萨姆布鲁克（Sambrook)等人，分子克隆实验指南（MolecularCloning:A LaboratoryManual)(第三版，冷泉港实验室出版社（ColdSpringHarborLaboratory Press),冷泉港（ColdSpringHarbor),纽约州（N.Y. )2000)。结合本文中所述的实验室 程序和技术使用的命名法是本领域中熟知并且常用的命名法。
[0026] 如根据本文中提供的例示性实施例所用，除非另外指示，否则以下术语应理解为 具有以下含义：
[0027] 如本文中所用，术语"扩增"和其变化形式包括用于产生聚核苷酸的至少某一部分 的多个拷贝或互补序列的任何过程，所述聚核苷酸典型地称为"模板"或在一些情况下称为 "标靶"。模板（或标靶）聚核苷酸可以是单链或双链的。既定模板的扩增可以导致产生一 群统称为"扩增子"