利用人工合成mv6序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用人工合成MV6序列 培育抗花叶病甘蔗品种的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 甘蔗花叶病是由马铃薯Y病毒属（Potyvirus)甘蔗花叶病毒亚组的成员甘蔗花叶 病毒（Sugarcane Mosaic Virus, ScMV)和高梁花叶病毒（Sorghum Mosaic Virus, SrMV)引 起的。Potyvirus病毒基因组长约10kb，编码一个多聚蛋白，经自身编码的蛋白酶降解形成 10个多肽，分别为PI、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。该病为一种传播性的 病毒病，至今全世界各大蔗区普遍发生，并成为蔗区的重要病害之一。大田研宄表明，当病 毒的侵染率达75%时，甘蔗的产量降低5%~19%，而且蔗汁中还原糖增加，降低蔗糖的结 晶率。
[0003] 甘蔗是一个高度多倍性，高度杂合性的作物，主要栽培种在正常栽培条件下又难 于开花，用常规方法难以培育抗花叶病毒新品种，利用基因工程技术培育转基因抗病毒植 株，国内外都有报道，获得的转基因植株对甘蔗花叶病的抗性明显提高。但大多研宄者是将 单一的CP及HC全序列基因导入到甘蔗中，获得的转基因植株只能是针对单一株系的花叶 病毒有抗性。目前，世界蔗区至少存在有7个ScMV和SrMV病毒株系，包括属于ScMV的株 系ScMV-A，B，D，E和属于SrMV的株系SrMV-H，I，M，并且蔗区中花叶病毒的优势株系在自然 条件下也会发生变化，并产生新的株系。因此，仅以单一株系的花叶病毒的单一基因为靶标 的转基因改良显然无法应对蔗区病原株系多样化、复杂化以及优势株系的变化。
[0004] RNAi (RNA interference)技术提供了一种能直接有效地人为控制基因表达的方 法，它能够引起基因在转录水平的高效沉默，将任何目的基因序列插入RNA干扰载体，均可 获得沉默靶标基因的效应。而且，引发RNAi的片段并不需要完整的基因序列，还可以是多 个病毒的不同基因片段的嵌合体，因此，RNAi针对的靶标基因也可以是多个不同病毒的基 因片段。为此，我们将收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序 列分别进行多序列比对，从中分别选取3条和4条长度大于30bp且100%同源的序列区段， 采用人工合成的方式串联在一起，作为RNAi干扰片段，构建反向重复序列，得到一个RNAi 载体。通过基因枪轰击法遗传转化甘蔗，获得具有沉默病毒基因表达效果的转基因甘蔗。
[0005] 专利号为ZL20071009226. 8的发明专利"利用SrMV-Pl基因培育抗花叶病甘蔗品 种的方法"，介绍了一种利用SrMV-Pi基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P i基因 的克隆、抗花叶病甘蔗转Pi基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P :基因材料的培育 以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种利用人工合成序列MV6培育抗花叶病甘蔗品种的方法。 针对现有蔗区甘蔗花叶病严重的问题，人工合成可同时沉默甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒 的新型核酸序列，构建RNAi载体，通过基因枪轰击法进行遗传转化，获得对花叶病高抗的 转基因甘蔗。
[0007] 本发明的目的是通过以下方法实现的。
[0008] 本发明的利用人工合成MV6序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV6序列的 人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在 于：
[0009] (1)MV6序列的人工合成：
[0010] 从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MV6序列，同时在正义 链5'端加入Xba I和XhoI酶切位点，反义链5'端加入Cla I和KpnI酶切位点，采用 人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：
[0011] GATCTAGACT CGAGTGCCAA GATACGGACT TCAGCGAAAC TTAACCGACT ATAAAGAGCT
[0012] AGAGAGGCCC ACATGCAGAT GAAAGCAGCA GCAGTATGGA AAAAAGTTAC GTCGATCTCT
[0013] TAAACCAAGC ATGGGCAGCT CTATTTCAAC CAAACTCCAC CACAGTTTAT GTAAATGCAC
[0014] TCTCTGTTGG GAGTGCAGCA GCACCACTAG TCTCCTGGAA ACCCTGTTTG CAGTACCTAT
[0015] GGAAAATTTT CAGCAATATG GCGTGTGTTC AAGTCAGCTC TACTTTAACC AAACTCCGCA
[0016] ACGGTTTGGT ACCATCGATA G
[0017] 所述从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，指将收集到的ScMV各 病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，从中分别选取3 条和4条长度大于30bp，且100%同源的序列区段串联在一起，共293bp，为目标RNAi干扰 序列。
[0018] (2) RNAi干扰载体构建：
[0019] (a)目的片段I的获得：利用限制性内切酶Kpn I和Xho I将目的片段A进行酶 切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段I;目的片段I的序列为序列 表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0020] (b)目的片段II的获得：将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Kpn I和Xho I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段II，目的片段II的序 列为序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列；
[0021] (c)中间载体B的获得：将回收的目的片段I和目的片段II用T4-DNA连接酶进行 连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B;所述中 间载体B是指将目的片段I插入到pHANNIBAL载体后获得的载体；
[0022] ⑷目的片段III的获得：提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶ClaI和 XbaI进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段III;目的片段III 的序列为序列表中SEQIDN0:4所示的核苷酸序列；
[0023] (e)目的片段IV的获得：将目的片段A用限制性内切酶ClaI和XbaI进行酶切， 将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段IV;目的片段IV的序列为序列表 中SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；
[0024](f)中间载体C的获得：将回收的目的片段III和目的片段IV用T4-DNA连接酶进行 连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C ;所述中 间载体C是指将目的片段IV插入到中间载体B后获得的载体；
[0025] (g)目的片段V的获得：提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶Not I进 行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段V;目的片段V的序列为 序列表中SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；
[0026] (h)目的片段VI的获得：将植物表达载体pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶 Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段VI ;目的片段VI 的序列为序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；
[0027] ⑴抗甘蔗花叶RNAi干扰载体pG0229i_MV6的获得：将回收的目的片段V和目的 片段VI用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆 验证，获得可用于遗传转化甘蔗受体材料的RNAi干扰载体pG0229i-MV6 ;
[0028] (3)抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载 体pG0229i-MV6质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1 y g/ y 1， 基因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗 病性鉴定。
[0029] 所述pHANNIBAL载体、pGreenII0229载体、大肠杆菌DH5a，均由商业购买获得。
[0030] 利用本发明的人工合成MV6序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，在人工接种条件 下，分别接种了属于ScMV株系的ScMV-A，D，E和属于SrMV株系的SrMV-H，M共5个株系的 花叶病病毒，对照发病率分别达到了82. 9%、87. 7%、86. 8%、90.5%和88.3%，而转基因 甘蔗均无发病，说明转入人工合成的MV6基因后提高了甘蔗抗多种花叶病毒的能力。采用 本发明的方法筛选获得的转基因植株，都具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性 高的特点。
[0031] 本发明的优点和有益效果：
[0032] 1.本发明获得的植物表达载体采用了 RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种摆脱了对 抗源基因的依赖。
[0033] 2.本发明人工合成的核酸序列包含3段与ScMV各病毒株系核酸序列100%同源 和4段与SrMV各病毒株系核酸序列100%同源的序列区段，作为RNAi序列，获得的转基因 植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。
[0034] 3.本发明获得的RNAi干扰载体用于转基因甘蔗，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病 育种周期。
【附图说明】 [0035] 图1为构建完成的pG0229i-MV6质粒图谱。
【具体实施方式】 [0036] 为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以 说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如 无特殊说明均可从商业途径获得。
[0037] 实施例一：构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体
[0038] 构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体的方法，包括以下步骤：
[0039] 1、MV6序列的人工合成：
[0040] 将收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行 多序列比对，从中分别选取3条和4条长度大于30bp且100%同源的序列区段，然后将选 取出来的7条序列区段采用人工合成的方式串联在一起，共293bp，即为目标RNAi干扰序 列；同时在