一种异麦芽酮糖的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种异麦芽酮糖的制备方法，具体涉及一种直接利用微生物转化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法，属于生物发酵技术领域。
【背景技术】
[0002]异麦芽酮糖(Isomaltulose)，又称帕拉金糖，化学名称为a -D-卩比喃葡糖基-1，6-D-果糖，是一种葡萄糖和果糖以α -1, 6-糖苷键结合形成的还原性二糖，天然存在于蜂蜜中，是蔗糖的同分异构体，其口感和物理性质与蔗糖非常相似，而甜度只有蔗糖的一半左右。由于人体本身无法消化异麦芽酮糖，只有被肠道微生物缓慢分解后才能进入血液而被人体吸收，因此，食用后在血液中释放单糖的速度比蔗糖慢而且不刺激胰岛素分泌，因而有益于糖尿病的防治并可防止脂肪的过多积累。由于异麦芽酮糖特殊的生理功能，作为一种健康食品添加剂，在特定条件下可以作为蔗糖替代品应用于食品工业。
[0003]异麦芽酮糖的批量生产起源于20世纪80年代中后期，是以蔗糖为原料，在蔗糖异构酶(α-葡糖基转移酶，EC.5.4.99.11)的作用下，将蔗糖分子中葡萄糖与果糖相连的α -1, 2-糖苷键变位为α -1, 6_糖苷键，形成一种与蔗糖物理、化学性质和生理功能完全不同的新糖，即异麦芽酮糖。目前，用于异麦芽酮糖生产的蔗糖异构酶来源于各种微生物，如克雷伯氏菌(Klebsiella)、精I元杆菌属(Psedumonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、农杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属(Psedumonas)等。
[0004]目前，世界各国如德国、美国、日本、中国等均采用固定化酶法生产异麦芽酮糖。中国专利文献报道的异麦芽酮糖制备方法，摘录如下:
[0005]中国专利CN1030530C，固定化α -葡糖基转移酶制备帕拉金糖，该发明公开了通过α -葡糖基转移酶菌种发酵、固定化、蔗糖转化及浓缩结晶而制得帕拉金糖的工艺，其工艺过程中采用高岭土吸附并收集发酵液中的菌体，然后采用海藻酸钠与菌体混合，滴入到氯化钙中进行固定化，再经戊二醛交联处理制得用于转化蔗糖液的固定化酶。该专利的固定化酶制作方法中使用戊二醛作为交联剂，网络百科中注明戊二醛对人体健康有危害:戊二醛对眼睛、皮肤和粘膜有强烈的刺激作用，吸入可引起喉、支气管的炎症、化学性肺炎、肺水肿等；因此，该专利固定化酶方法在食品加工领域中使用存在着食品安全隐患缺陷。
[0006]中国专利CN101200750A，一种大黄欧文氏菌及其在制备异麦芽酮糖中的应用，该发明公开一种大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)ΝΧ-5及利用该菌生产鹿糖异构酶进而制备异麦芽酮糖的方法。专利中的固定化方法为:配制I?3% (即I?3g/100mL)浓度的海藻酸钠，加入10?25%的细胞(即每10mL海藻酸钠溶液中加入10?25克的细胞)，并添加5?10%硅藻土(即每10mL海藻酸钠溶液中加入5?10克的硅藻土)，再用浓度为I?4%的CaCl2溶液(g/100mL)将包埋材料海藻酸钠固定成型，以此作为酶源进行反应。具体地说:将游离含蔗糖异构酶的细胞或固定化后含蔗糖异构酶的细胞填充至反应罐中，加入45?600g/L的蔗糖溶液，或者将按照上述固定化方法制得的固定化细胞装入填充式柱反应器中，柱的体积不限。该反应器可以0.5?5mL/min单向流加或循环连续流加450?600g/L的蔗糖溶液，在25?35°C的条件下进行酶转化反应，反应时间10?15h，通过调整流速，控制蔗糖的转化率在90?100%之间，将收集流出液，浓缩结晶得到异麦芽酮糖。该专利的固定化菌体方法及蔗糖酶转化方法生产效率低，仅适合制作少量样品时使用。因此，该专利方法存在异麦芽酮糖产业化生产困难的缺陷。
[0007]中国专利CN101591689A，生物酶法转化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法，该发明所述固定化细胞在反应罐内和蔗糖溶液充分混合，固定化细胞悬浮在蔗糖溶液中，同时施加包括机械搅拌，压缩空气翻动，循环泵等搅拌作用，使固定化细胞核蔗糖溶液充分接触，加快转化速度，直至转化液中的异麦芽酮糖含量达到85%以上。该方法施加诸多的强烈地物理性搅拌行为，容易造成固定化细胞的机械性损伤、破碎，使固定化细胞的酶活性快速丧失而缩短固定化细胞的使用寿命，造成生产成本的大幅上升。因此，该专利方法存在异麦芽酮糖产业化生产成本高的缺陷。
[0008]中国专利CN102071235A，利用超声波促进酶制剂高效转化异麦芽酮糖的方法，该发明的菌体包埋固定化及转化过程为:将细胞浓浆1mL与1mL质量分数2?4%的海藻酸钠溶液以及100?100mg玻璃纤维粉(50?1000 μ m左右)混合，用注射器滴加到200mL0.2mol/L的CaCl2S液中，25?30°C下静置固化2小时后，过滤洗涤；将颗粒体移至200mL质量分数为0.1?0.2%的戊二醛溶液中，于33?37°C交联2小时后，过滤洗涤后，得到球状固定化酶；将固定化酶装入转化罐中并固定好，始终保持无污染状态；转化罐中设置有超声波发射器，可发射一定频率及强度可根据需要调整设定。该专利使用注射器制作固定化颗粒体的方法耗时，不适用于工业化生产；同时，网络百科中注明戊二醛对人体健康有危害:戊二醛对眼睛、皮肤和粘膜有强烈的刺激作用，吸入可引起喉、支气管的炎症、化学性肺炎、肺水肿等。因此，该专利固定化酶方法在食品加工领域中使用存在着无法产业化和食品安全隐患等缺陷。
[0009]中国专利CN102286454A，聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法，该发明公开了一种聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法，利用聚乙烯醇或/和硅藻土比例为2:0.8?1.21的酶载体4?50% (W/W)水溶液浆液，在温度25?30°C加入产蔗糖异构酶湿菌体5?30% (W/W)，搅拌均匀后置于-20°C以下硬化备用，使用时将固定化酶菌取出置于室温下自然解冻，然后切成颗粒，加入蔗糖溶液异构转化，再用产蔗糖异构酶分解转化液中残留的蔗糖，然后将转化液采用脱色和离子交换进行纯化，经浓缩结晶，离心分离后制得异麦芽酮糖产品。该专利使用聚乙烯醇制备固定化酶，在网络百科词条收集内容中聚乙烯醇对人体健康有危害性，吸入、摄入或经皮肤吸收后对身体有害，对眼睛和皮肤有刺激作用。因此，该专利固定化酶方法在食品加工领域中使用存在着食品安全隐患缺陷。
[0010]以上专利所公开的异麦芽酮糖制备所采用的菌体固定化方法及制备工艺存在以下不足:
[0011]1、固定化操作过程繁琐、耗时、成本高，方法只适用于制备少量固定化酶，无法在工业化生产中推广使用；
[0012]2、固定化载体使用了一些对人体有害的化工材料对食品安全构成了危害，如戊二醛、聚乙烯醇等；
[0013]3、在蔗糖异构化过程中，采用强烈地机械搅拌方式，容易造成固定化菌体破碎，不利于长期保持固定化菌体的活性，从而增加了生产成本。
【发明内容】
[0014]针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种操作简便、设备投资少、生产成本低，且无食品安全隐患、能够实现工业化生产的异麦芽酮糖的制备方法。
[0015]为实现上述目的，本发明采用下述技术方案:
[0016]一种异麦芽酮糖的制备方法，步骤如下:
[0017](I)以蔗糖溶液为原料，将蔗糖溶液和具有α-葡萄糖基转移酶的固定化菌体在转化罐中混合，固定化菌体的加入量为蔗糖溶液的5?10% (W/W);通入无菌压缩空气，在温度为25?32°C和pH5?7.5的条件下进行转化，当转化液中蔗糖残留量在2%以下时结束转化；
[0018](2)将步骤(I)的转化液经脱色过滤和离子交换净化工序，再经浓缩、降温结晶，得到异麦芽酮糖晶体。
[0019]步骤(I)中，所述蔗糖溶液为Brix40?60%的蔗糖溶液；
[0020]步骤(I)中，所述具有α -葡萄糖基转移酶的固定化菌体的制备方法为:
[0021]I)配制海藻酸钠溶液??每100 kg水添加2?6 kg海藻酸钠，对海藻酸钠溶液进行搅拌成均勾胶体，搅拌速度为50?300r/min，搅拌时间10?30分钟；
[0022]2)氯化妈溶液制备:每100 kg水添加5?10 kg氯化妈、20?30 kg鹿糖，搅拌溶解；
[0023]3)将能够产α -葡萄糖基转移酶的菌的细胞浓浆与海藻酸钠溶液按体积比1:(I?3)混勾，搅拌时速50?100r/min，搅拌时间5?15分钟；
[0024]4)将混匀好的细胞浓浆与海藻酸钠混合体移入制粒装置中，通过制粒装置获得5?1mm的球状至短棒状的菌体，将菌体移入氯化钙溶液中进行固定化，固定化时间为2?4小时，得到固定化菌体；
[0025]进一步的，所述具有α -葡萄糖基转移酶的固定化菌体的制备方法，还包括步骤5)将固定化好的菌体用浓度Brix25-35%的蔗糖溶液洗涤；除去附在固定化菌体表面上的氯离子、钙离子等杂质，减轻后续工艺中过滤、离子交换工序的压力。
[0026]步骤3)中，所述能够产α -葡萄糖基转移酶的细胞浓浆的制备方法为:
[0027]将能够产α -葡萄糖基转移酶的菌接种至发酵培养基中，通过多级扩大发酵获得所需量的菌体，发酵温度为25°C?30°C，pH6.0?7.5，发酵罐通气量0.3?1.2m3/min，搅拌速度100?300r/min，培养时间12?48小时；
[0028]将发酵后的菌体进行离心，收集细胞浓浆，即得；离心机转鼓分离最小颗粒小于0.5微米，离心采用10000?15000r/min离心转度，整个收集细胞浓浆过程温度控制在15 ?30?。
[0029]所述能够产α-葡萄糖基转移酶的菌选自红色精朊杆菌(Protaminobacterrubrum)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)、大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)或克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)。
[0030]步骤4)中，所述制粒装置包括筒体，筒体底部设有孔径为2?5mm的小孔，开孔面积占筒体底部面积的90-95%，筒体内设有容纳物料的空腔；与筒体内径相同的活塞与压杆相连，并通过压杆在筒体内做往复运动。
[0031]步骤(I)中，所述转化罐为具有冷热交换功能的不锈钢罐，包括罐体，所述罐体外壁设有夹套层，罐体的底部设有拦截固定化菌体的网状装置，所述网状装置的下方设有无菌压缩空气进气管。
[0032]进一步的，所述罐体内设有换热管，所述换热管为列管、盘管或蛇管。
[0033]通过夹套和/或罐内换热管的冷水或热水的冷热交换调节不锈钢罐内转化液的温度。
[0034]所述网状装置是指满孔洞的不锈钢花板或不锈钢筛网，孔洞可以是圆形、方形、三角形等形状，孔洞直径2_左右。
[0035]所述无菌压缩空气是指经过除尘、除油水及除菌空气过滤器处理后的压缩空气，在0.04Mpa条件下，气体流量为0.5?1.5m3/m