用于检测玉米植物dbn9927的核酸序列及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测玉米植物DBN9927的核酸序列及其检测方法，特别是涉 及一种对昆虫具有抗性且耐受草甘膦除草剂施用的转基因玉米事件DBN9927和用于检测 生物样品中是否包含特定转基因玉米事件DBN9927的核酸序列及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 玉米（Zea mays L.)在世界上很多地区都是主要的粮食作物。生物技术已经应用 于玉米以改善其农艺性状和品质。在玉米生产中昆虫抗性是一项重要的农艺性状，特别是 对鳞翅目昆虫的抗性，例如玉米螟、棉铃虫、黏虫等。玉米对鳞翅目昆虫的抗性可以通过转 基因的方法使鳞翅目昆虫的抗性基因在玉米植物中表达而获得。另一个重要的农艺性状是 除草剂耐受性，特别是耐受草甘膦除草剂。玉米对草甘膦除草剂的耐受性可以通过转基因 的方法使草甘膦除草剂耐受型基因（如EPSPS)在玉米植物中表达而获得。
[0003] 已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色 质结构（如异染色质）或转录调节元件（如增强子）接近整合位点。为此，通常需要筛选大 量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件（即导入的目标基因得到最优表达的事件）。 例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在 表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在 差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所 预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选 出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因 表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其 他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征。应用 这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好的适应当地 的生长条件。
[0004] 能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。 此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投 入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因 的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应（PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检 测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的 转基因DNA相邻的染色体DNA( "侧翼DNA"）的序列是己知的，上述这种方法就不能够用于 区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插 入的转基因和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说 是包含于侧翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测玉米植物DBN9927的核酸序列及其检测方法， 转基因玉米事件DBN9927对昆虫具有较好的抗性并对草甘膦除草剂具有较好的耐受性，且 检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含特定转基因玉米事件DBN9927的DNA分 子。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供了一种核酸序列，SEQ ID N0:3或其互补序列中至少 11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID N0:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸。
[0007] 优选地，所述核酸序列包括SEQ ID NO: 1或其互补序列、和/或SEQ ID N0:2或其 互补序列。
[0008] 进一步地，所述核酸序列包括SEQIDN0:3或其互补序列、和/或SEQIDN0:4或 其互补序列。
[0009] 更进一步地，所述核酸序列包括SEQIDN0:5或其互补序列。
[0010] 所述SEQ ID NO: 1或其互补序列为转基因玉米事件DBN9927中在插入序列的5' 末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:1或其互补 序列跨越了玉米插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的5'末端的DNA序列，包含所 述SEQ ID N0:1或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9927的存在。所述SEQ ID N0:2或其互补序列为转基因玉米事件DBN9927中在插入序列的3'末端位于插入接合部位 附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:2或其互补序列跨越了插入序列的 3'末端的DNA序列和玉米插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID N0:2或其互 补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9927的存在。
[0011] 本发明中，所述核酸序列可以为所述SEQ ID N0:3或其互补序列中转基因插入序 列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸（第一核酸序列），或者为所述SEQ ID NO: 3或其互补序列中5'侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续 多核苷酸（第二核酸序列）。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述 SEQ ID NO: 1的所述SEQ ID N0:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时， 这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物组。使用DNA引物对在DNA 扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO: 1的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件 DBN9927或其后代的存在。本领域技术人员熟知的，第一和第二核酸序列不必仅仅由DNA组 成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作为一种或多种聚合酶模板 的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的长度，其可以选自5￡〇10勵：1、5￡〇10 N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5 中所述的核苷酸。当选自 SEQ ID N0:3、 SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约21 个到大约50个或更多的连续核苷酸。所述SEQ ID N0:3或其互补序列为转基因玉米事件 DBN9927中在插入序列的5'末端位于插入接合部位附近的一个长度为1178个核苷酸的序 列，所述SEQ ID N0:3或其互补序列由1048个核苷酸的玉米侧翼基因组DNA序列（SEQ ID NO: 3的核苷酸1-1048)、77个核苷酸的DBN10124构建体DNA序列（SEQ ID NO: 3的核苷酸 1049-1125)和53个核苷酸的tNos (胭脂碱合成酶）转录终止子的3'末端DNA序列（SEQ ID N0:3的核苷酸1126-1178)组成，包含所述SEQ ID N0:3或其互补序列即可鉴定为转基 因玉米事件DBN9927的存在。
[0012] 所述核酸序列可以为所述SEQIDN0:4或其互补序列中转基因插入序列的任何部 分的至少11个或更多个连续多核苷酸（第三核酸序列），或者为所述SEQ ID NO: 4或其互 补序列中3'侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸（第 四核酸序列）。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ ID N0:2 的所述SEQ ID N0:4的一部分。当第三核酸序列和第四核酸序列一起使用时，这些核酸序 列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物组。使用DNA引物对在DNA扩增方法中 产生的扩增产物是包括SEQ ID N0:2的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件DBN9927或 其后代的存在。所述SEQ ID N0:4或其互补序列为转基因玉米事件DBN9927中在插入序列 的3'末端位于插入接合部位附近的一个长度为1574个核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:4或 其互补序列由38个核苷酸的t35S转录终止子序列（SEQ ID NO:4的核苷酸1-38)、152个 核苷酸的DBN10124构建体DNA序列（SEQ ID N0:4的核苷酸39-190)和1384个核苷酸的 玉米整合位点侧翼基因组DNA序列（SEQ ID N0:4的核苷酸191-1574)组成，包含所述SEQ ID N0:4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9927的存在。
[0013] 所述SEQIDN0:5或其互补序列为表征转基因玉米事件DBN9927的长度为9801 个核苷酸的序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述SEQIDN0:5或 其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9927的存在。
[0014] 表1、SEQ ID N0:5包含的基因组及遗传元件
[0015]
【主权项】
1. 一种核酸序列，其特征在于，包括SEQ ID N0:3或其互补序列中至少11个连续的核 苷酸、和/或SEQ ID N0:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸。
2. 根据权利要求1所述核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID N0:1或其互 补序列、和/或SEQ ID N0:2或其互补序列。
3. 根据权利要求2所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID N0:3或其 互补序列、和/或SEQ ID N0:4或其互补序列。
4. 根据权利要求3所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID N0:5或其 互补序列。
5. -种检测样品中转基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法，其特征在于，包括： 使待检测样品与至少两种引物在核酸扩增反应中接触； 进行核酸扩增反应； 检测扩增产物的存在； 所述扩增产物包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、或者SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸。
6. 根据权利要求5所述检测样品中转基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法，其特 征在于，所述扩增产物包括SEQ ID NO: 1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷 酸、或者SEQ ID NO:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸。
7. 根据权利要求5或6所述检测样品中转基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法， 其特征在于，所述扩增产物包括SEQ ID NO: 1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、 SEQ ID N0:6或其互补序列、或者SEQ ID N0:7或其互补序列。
8. 根据权利要求5-7任一项所述检测样品中转基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方 法，其特征在于，所述引物包括至少一种权利要求1-5任一项所述核酸序列。
9. 根据权利要求8所述检测样品中转基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法，其 特征在于，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物选自SEQ ID N0:8和SEQ ID NO: 10 ;所述第二引物选自 SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 11。
10. -种检测样品中转基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法，其特征在于，包括： 使待检测样品与探针接触，所述探针包括SEQ ID NO: 3或其互补序列中至少11个连续 的核苷酸、或者SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸； 使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交； 检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。
11. 根据权利要求10所述检测样品中转基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法，其 特征在于，所述探针包括SEQ ID N0:1或其互补序列中第1-