检测braf基因v600e突变位点的引物、试剂盒及其pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了检测BRAF基因V600E突变位点 的引物、试剂盒及其PCR方法，用于BRAF基因V600E突变位点的快速检测。
【背景技术】
[0002] BRAF基因，位于染色体7q34,编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是RAF家族成员之 一，于1988年由Ikawa等首先在人类尤文氏肉瘤中发现并克隆确认，因其与CRAF和ARAF 具有相当高的同源性，故称其为BRAF。BRAF蛋白由783个氨基酸组成，从N端到C端依次 为CR1、CR2和CR3三个保守区。其中CR1区由RAS蛋白结合区和富含半胱氨酸区组成，这 两个区域均可与RAS结合；CR2富含丝氨酸/苏氨酸，为调节磷酸化RAF激酶活性；CR3区为 ATP结合位点和激活区，含有酪氨酸和丝氨酸残基及有多个磷酸化位点，其中T598和S601 最为重要，这两个位点同时磷酸化后可激活BRAF蛋白和诱导性激活ERK。BRAF突变发生在 近8%人类肿瘤中，主要发生于肺癌、结直肠癌、黑色素瘤和甲状腺乳头状癌中。据统计，约 15%的结肠癌患者中存在体细胞BRAF基因突变，绝大部分（90%以上)突变发生于外显子15 上的1799位核苷酸上，导致其编码的缬氨酸由谷氨酸取代（V600E)。其余10%突变位于外 显子 11 的甘氨酸环，如 R461I、I462S、G463E、G463V、G465A、G465E、G465V、G468A、G468E、 N580S、E585K、D593V、F594L、G595R、L596V、T598I、V600D、V600K、V600R、K601E、A727V 等。 研宄证实V600E突变后能够产生类似于T598和S601两个位点磷酸化的作用，使BRAF蛋白 持续激活，激活后的BRAF通过下游MEK/ERK传导通路刺激细胞的增殖和分化。
[0003] 一项针对转移性结直肠癌患者BRAF及KRAS突变与耐药间的相关性进行的回顾性 研宄发现，帕尼单抗或西妥昔单抗对携带BRAF突变的KRAS野生型患者无效，而治疗有效的 患者均无发生BRAF突变。研宄认为，KRAS突变可能导致30%~40%结直肠癌患者对EGFR靶 向治疗无效，而KRAS野生型患者若发生BRAF突变，则可能导致10%~15%患者产生耐药。
[0004] 美国国立癌症综合网络（NCCN)《结直肠癌临床实践指南》建议，在使用西妥昔单 抗和帕尼单抗等靶向治疗药物时，需检测肿瘤组织KRAS基因状态，如果KRAS无突变，应考 虑检测BRAF基因状态。此外，检测BRAF基因突变可帮助筛选出可受益于特异性针对BRAF 的靶向治疗药物的患者。
[0005] 目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP ;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-Taqman MGB (Minor Groove Binder)探针法；AS-PCR 法；Cast-PCR 法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。
[0006] 如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。
[0007] 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1; 14(3): 163-9，United States Patent 20120135406]。
[0008] 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。
[0009] 4) PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]〇
[0010] 5)PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见[J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8):2909-15;United States Patent 20090311679]，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。
[0011] 6)PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。
[0012] 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 多态性最简单快速的方法（Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Wallace R B.，Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR 的效率将会下降 1〇3-1〇6.6倍（Chen, X.，and Sullivan, P F, The Pharmacogeonomics Journal 2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（Ayyadevara S, Thaden J J, Shmookler Reis R J., Anal Biochem 2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加反 应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见[J Virol Methods. 2008 Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb;83 (2) :311-20]。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应 条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了 PCR的污染机会， 而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或 无"式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩 增，只是其得到的Ct (Cycle threshold)不同而已，因此就引入了 ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要ACt值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，ACt值 小于杂合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为 ACt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有 不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见[中国专利CN101235415， CN101565742A]〇
[0013] 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR ( Competitive allele specific Taqman PCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见[Exp Mol Pathol. 2012 Jun; 92 (3): 275-80; United States Patent 20100221717 ;CN102428190A]。有人采用锁 核酸（LNA) ( Plant Method 2007, 3 :2)或修饰的碱基（Anal Biochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并 需对反应进行深度优化。
[0014] 目前，国内已上市有注册证的BRAF基因检测试剂盒有：北京雅康博生物科技有限 公司的"人BRAF基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）"，国食药监械（准）字2014第3401045 号。
[0015] 国内苏州工业园区为真生物医药科技有限公司申请的BRAF基因突变的快速检测 的专利（专利号CN 101875971 A)，其采用饱和探针和高分辨率溶解曲线分析