检测人类免疫缺陷病毒1型的pcr引物组、探针及其试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测领域，涉及一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR引物组、探 针及其试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 艾滋病即获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，是一种慢性致死性传染病，由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV)引起，分为人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1)和人类免疫缺陷病毒2型（HIV-2)，HIV-1 是目前全球包括中国在内流行的主要毒株，HIV-2型目前只在西非流行。HIV感染后导致 人体免疫机能缺陷，从而发生机会性感染和肿瘤等一系列临床综合征，病死率几乎达100%。 根据2011年数据，艾滋病已经波及全球200多个国家和地区，感染者总数已超过6000万， 2000万人死于艾滋病。由于该病潜伏期长、隐蔽性强、传播途径多样化、病死率高，目前既无 能治愈的药物也无有效的疫苗预防，给防治工作带来了严重困难。
[0003] 我国目前处于HIV/AIDS广泛流行期，政府采取了一系列坚决的措施，已经有效地 控制了非法采供血行为，用血安全性得到最大限度的保障，但是经静脉注射吸毒和经性传 播HIV的势头并未得到很好的控制，尤其是性传播已成为主要传播方式，而且在一些地区 已出现HIV感染者的第二代传播（母婴传播、家庭内性传播等），对全国HIV/AIDS的流行 蔓延无疑起到推波助澜之作用。按照国家2014年最新颁布的治疗标准，其中超过8成需要 立即开展和持续终生高效抗逆转录病毒治疗（Highly active antiretroviral therapy， HAART)，在公卫、临床、立法、治安等多方面均形成严重挑战。扩大HIV检测和抗病毒治疗， 早诊早治，降低新发数和病死率，是我国"十二五"以来艾滋病整体防控的战略目标。
[0004] 目前国内外HIV检测主要存在以下问题： (1) "窗口期"（指感染后到体内产生抗体、并达到检出水平之间这段时间，期间具有感 染性但抗体检测为阴性，受不同检测方法和个体差异影响)及早期诊断。HIV感染后确定感 染的病毒标志物依次出现的顺序为：病毒核酸（RNA与前病毒DNA)、病毒蛋白（如p 24抗 原)、病毒抗体。目前，国内外HIV常规检测主要还是抗体血清学检测（ELISA、WB)。此技术 已建立20余年，成熟可靠，然而一直受所谓"窗口期"问题的困扰，"窗口期" 一般在40天 以上。核酸检测方面，由于病毒标志物出现更早，在窗口期前移上具有抗体检测技术不可比 拟的优势。但受灵敏度限制，目前外周血血清HIV RNA检测（目前国内外已上市的病毒载量 检测试剂盒检出限在20~200拷贝/mL之间）仍有11天左右窗口期。
[0005] 虽然HIV-1是逆转录病毒，具有传染力的病毒子是RNA，但是HIV进入人体后，会进 入到CD4+ T细胞，靠自身的逆转录酶逆转录为DNA，也就是通常所说的前病毒，然后整合到 细胞的基因组中，从而感染T细胞。目前国内已上市的HIV-1核酸检测试剂盒是通过检测 血里面的HIV RNA浓度来诊断是否艾滋病感染。在早期感染或正在进行抗艾滋病治疗的患 者中，游离病毒子很少，而且病毒RNA在提取过程中容易降解，这类试剂盒难以检测到。但 是细胞中还是有整合的HIV病毒基因，一旦人的免疫能力下降或者未及时用药，这些整合 的病毒子就会开始复制，使病情发展。
[0006] (2)病毒储存库检测。临床对HIV抗病毒治疗的结果评价分为"彻底治愈"和"功 能性治愈"。前者要求实现长期不进行任何抗病毒治疗，体内仍检测不到HIV核酸；后者效 果类似病毒精英控制者，体内仍可检测到低水平的HIV-1 RNA和/或DNA，但长期免于HIV 相关疾患的损害。后续的研宄发现，接受HAART治疗患者体内其实一直存在着另一种潜伏 形式的HIV-1，即所谓病毒储存库。chun等1997年首次发现了整合在静止的记忆性⑶4+T 淋巴细胞中的病毒储存库，其中小部分含有整合的HIV DNA，可以在某种刺激下重新开始复 制-组装病毒。这些潜伏的感染细胞十分稳定，因此病毒储存库已被广泛认为是HAART无 法从患者体内清除HIV的主要原因和艾滋病治愈的最大障碍。
[0007] 近年来病毒储存库相关主要检测技术包括：①QVOA (Quantitative viral outgrowth assay)，又名 IUPM (Infectious Units Per Million)分析，由 Siliciano 和Siliciano 2005年建立。该方法对人员和设备要求较高，价格昂贵，样本需求量大 (120-180mL血液)，费时费力，且结果准确性影响因素众多，检出率偏低，也不适用于组织活 检。②⑶4+T淋巴细胞计数，多采用⑶4/8/3流式仪检测，但没有证据表明能直接反映HIV 病毒储存库的变化，有无一定相关性尚待进一步求证。③RNA检测。如上述，由于HAART能 够非常有效地控制患者血浆HIV-1 RNA含量，甚至将其降低至临床常规检测的低限（20-50 拷贝/mL)以下，而且RNA检测对设备、人员及标本提取要求较高，因此其无法应用于病毒储 存库检测。
[0008] (3)新生儿HIV感染的诊断。HIV感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在，用抗体 检测法通常为阳性。但实际上只有20%~60%的婴儿可在母亲的子宫里、在分娩和引产或 通过产后哺乳时从其母体感染HIV。新生儿血清阳性者并不能说明是HIV感染。因为母体 HIV抗体可持续大约15个月之久，在一般情况下，婴儿并不表现出HIV感染的任何症状。病 毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法；HIV特异IgM抗体的检测在母体抗体存 在下也是不可能的，在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV抗原也十分困难。对这些婴 儿用可靠的核酸方法进行HIV感染的早期诊断是十分重要的。另外，婴幼儿被HIV感染后 病情发展较快，早期诊断对及时采取治疗措施，延缓阻止病情发展极为重要。
[0009] 综上所述，传统的HIV检测方法，受限于"窗口期"、耗时、花费及标本要求高以及 检测灵敏度低等特点，亟需开发一种高敏感的HIV DNA检测方法。目前国内外鲜见有HIV DNA检测试剂盒，有文章报道的HIV DNA PCR检测方法灵敏度均在每百万细胞检测到10拷 贝HIV DNA或以上。
【发明内容】
[0010] 为了解决上述问题，本发明通过大量实验研宄筛选出高灵敏和高特异性的引物序 列和检测探针，及特定的PCR反应程序和条件，构建了高敏感HIV-1 DNA PCR检测试剂盒及 检测方法，最低检测限可达每个反应可检测2拷贝HIV-1 DNA/百万细胞。
[0011] 本发明的目的在于提供检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR引物。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒。
[0013] 本发明的再一目的在于提供一种检测检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测方 法。
[0014] 本发明所采取的技术方案是： 检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR引物组，该引物组为引物组1或引物组2或引物组 3,其中， 引物组 1 由 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 组成； 引物组 2 由 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 组成； 引物组 3 由 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成。
[0015] 检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测探针，其序列为：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21 和 SEQ ID N0:22;或者为该些序列的核苷酸互补序列。
[0016] 进一步的，上述探针序列5'端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种， 探针序列3'端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。
[0017] 一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒，该试剂盒含有至少一组上述 所述的引物组。
[0018] 进一步的，上述试剂盒还含有检测探针；具体探针情况如下： 当试剂盒中含有引物组1时，该试剂盒就还含有探针SEQ ID N0:15或其核苷酸互补序 列； 当试剂盒中含有引物组2时，该试剂盒中就还含有探针SEQ ID NO: 16、SEQ ID N0:17、 SEQ ID NO: 18或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针； 当试剂盒中含有引物组3时，该试剂盒中就还含有探针SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、 SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针。
[0019] 进一步的，上述试剂盒还含有细胞定量引物组和细胞定量探针，所述细胞定量引 物组由 SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25 和 SEQ ID N0:26 组成；所述探针为 含SEQ ID NO:27或者为其核苷酸互补序列； 细胞定量探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于上述 检测目的基因探针的荧光基团。
[0020] 进一步的，上述试剂盒还含有：强阳性对照品、弱阳性对照品、阴性对照品、阳性定 量参考品和含有酶与UNG酶的酶系。
[0021] 进一步的，上述阳性定量参考品为8E5或Ach2细胞株基因组，用于同时对HIV DNA 及细胞数定量。
[0022] -种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) DNA提取： 取待测全血样本、阴性质控品、弱阳性质控品、强阳性质控品、阳性定量参考品各 200 yl，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取试剂盒，按说明书操作，分提取各组样品的 DNA作为模板； 2) PCR反应体系： PCR 反应液 29. 2 y L ; 酶系 0.8yL; DNA模板 20 y L ; 3) PCR反应程序： 以A