一种重组单纯疱疹病毒滴度的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒感染性的定量测定方法，更具体涉及到重组单纯疱瘆病毒感染性的空斑形成单位定量定量测定法，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002]病毒感染性的定量是确定单位体积的病毒溶液所包含的具有感染力的病毒的数量，病毒感染性定量无论是在学术研宄中还是在商业生物产品研发上都具有重要运用价值，例如生产的病毒疫苗、用病毒载体表达的重组蛋白和病毒抗原等都需要运用到病毒定量。目前病毒感染性定量方法主要有空斑实验法、50%组织培养物感染剂量法、血凝集实验法、酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量PCR方法等等。空斑实验法是个传统的经典实验方法，它是由噬菌斑定量法发展而来。空斑实验法目前还是病毒定量方法中运用最广泛的一种方法，但由此方法又衍生发明出了很多空斑实验方法，然后这些技术方法的基本原理都是通过测定病毒在单层贴壁细胞中繁殖感染形成的空斑的能力来确定病毒的滴度，定量时间周期较长，操作不够简便。
【发明内容】
[0003]本发明针对目前病毒感染性定量方法定量时间周期较长，操作不够简便之不足，而提供一种有关重组单纯疱瘆病毒病毒滴度的测定方法。
[0004]本测定方法为:
1.在34.8 _直径的塑料细胞培养皿或6孔板中传代3 X 16个Vero细胞，每个孔加2 mL细胞生长液。
[0005]2.将传代后的细胞培养皿放置在37°C含5%C02的细胞培养箱中过夜，待细胞生长密度达到70-90%准备接种病毒悬液。
[0006]3.将病毒在磷酸盐缓冲液(PBS)中做10倍梯度稀释，具体方法是准备5管EP管，每管中加900 μ L PBS，编号I号，2号，3号，4号，5号。吸取100 μ L病毒存储液，加入到I号EP管中，盖上盖子，涡旋混匀。再用新的枪头吸取100 UL I号EP管中混合液，加入到2号EP管中，盖上盖子，涡旋混匀，依次操作，到5号EP管时得到的是10_5稀释度的病毒液。做梯度稀释时，每次都要换新枪头，并且枪头吸取病毒液后应对着EP管内壁悬空加，不要将枪头伸入到PBS液面下加，因为枪头外壁很容易粘上液滴，会造成误差。
[0007]4.将Ve1细胞培养皿中的细胞生长液吸出扔弃，分别吸取各稀释度的病毒液100μ L加入上单层Vero细胞中，枪头吸取病毒液后往细胞培养皿中加入时要缓慢，以免将细胞冲散。加入后要在平台上将培养皿上下左右慢速晃动，以使病毒液覆盖到全部细胞表面。
[0008]5.放入37°C含5%C02的细胞培养箱I个小时，使病毒吸附进入细胞内。
[0009]6.将2%琼脂糖溶液和病毒生长液分别加热到42°C，取等体积的这两种溶液混合，配成含1%琼脂糖的病毒生长液。温度合适的确定方法是瓶子放手上不烫，否则温度过高会杀死细胞。迅速将达到42°C的琼脂糖病毒生长液加入到细胞表面，轻轻晃动铺匀，这样可以阻止病毒颗粒从细胞中出来后通过培养基扩散而导致空斑蔓延，超净工作台上静置I分钟待琼脂糖凝固。
[0010]7.再将培养皿放入5% CO2的细胞培养箱，将培养箱温度调到35 °C，放置2天。
[0011]8.将细胞培养皿放置在倒置显微镜下，选取长了 20-200个空斑的培养皿计算空斑数量，长得太多或太少的都不用计数，然后计算每毫升空斑数(PFU)，取平均值。病毒滴度计算公式如下:
PFU/mL=空斑数量X 1X稀释倍数
例如在10_5稀释度的细胞培养皿里长的了 20个空斑，那么病毒滴度就是:PFU/mL=20X 10X 105=2X 1079.试剂溶液配方:
磷酸盐缓冲液(PBS):
1.4 mM KH2PO48 mM Na2HPO4140 mM NaCl
2.7 mM KCl,pH 7.3细胞生长液:
5OOmL MEM Medium100U/mL青霉素lOOPg/mL链霉素)
10% Fetal bovine serum琼脂糖溶液:
2g琼脂粉 10mL双蒸水病毒生长液:
5OOmL MEM Medium100U/mL青霉素lOOPg/mL链霉素)
0.2%牛血清白蛋白组分V 25mM HEPES缓冲液 2Pg/mLTPCK-胰酶
本发明的优点:本发明不需要染色就可以确定病毒滴度的空斑实验法，使对重组单纯疱瘆病毒滴度的定量时间周期短，操作简便，重复性好、材料设备要求低，可以在广大实验室和生产研发单位推广使用。
[0012]
【附图说明】
[0013]附图1:重组单纯疱瘆病毒病毒滴度测定方法的流程图附图2:感染mtHSV两天后的Vero细胞附图3:感染mtHSV两天后的Vero细胞
【具体实施方式】
[0014]实施例1:
1.在34.8 mm直径的塑料细胞培养皿中传代3 X 16个Vero细胞，加2 mL细胞生长液。
[0015]2.将传代后的细胞培养皿放置在37°C含5%C02的细胞培养箱中过夜，待细胞生长密度达到80%准备接种病毒悬液。
[0016]3.制备 Kr1，1(Γ2，Kr3, 10-4，I(Γ5稀释度病毒接种液各 1000 μ L。
[0017]4.将Vero细胞培养皿中的细胞生长液吸出扔弃，吸10_5稀释度病毒液100 μ L加入上单层Vero细胞中，轻轻晃动混勾。
[0018]5.放入37°C含5%C02的细胞培养箱I个小时。
[0019]6.加入含1%琼脂糖的细胞培养液溶液，轻轻晃动铺匀，超净工作台上静置2分钟待琼脂糖凝固。
[0020]7.再将培养皿放入5% CO2的细胞培养箱，将培养箱温度调到35 °C，放置2天。
[0021]8.在倒置显微镜下，10_5稀释度的孔长了 20多个空斑，拍摄照片如附图2所示，空斑计数达到22个，根据公式得到病毒原液滴度为
PFU/mL=2.2 X 10 X 105=2.8 X 1(Γ7 实施例2:
1.在34.8 mm直径的塑料细胞培养皿中传代3 X 16个Vero细胞，加2 mL细胞生长液。
[0022]2.将传代后的细胞培养皿放置在37°C含5%C02的细胞培养箱中过夜，待细胞生长密度达到75%准备接种病毒悬液。
[0023]3.制备 ΙΟ' 1(Γ2，ΙΟ' 1(Γ4，1(Γ5稀释度病毒接种液各 1000 μ L。
[0024]4.将Vero细胞培养皿中的细胞生长液吸出扔弃，吸10_5稀释度病毒液100 μ L加入上单层Vero细胞中，轻轻晃动混勾。
[0025]5.放入37°C含5%C02的细胞培养箱I个小时。
[0026]6.加入含1%琼脂糖的细胞培养液溶液，轻轻晃动铺匀，超净工作台上静置2分钟待琼脂糖凝固。
[0027]7.再将培养皿放入5% CO2的细胞培养箱，将培养箱温度调到35 °C，放置2天。
[0028]8.在倒置显微镜下，10_5稀释度的孔长了 20多个空斑，拍摄照片如附图3所示，空斑计数达到25个，根据公式得到病毒原液滴度为:
PFU/mL=2.5X 1X 105=2.8X10'
【主权项】
1.一种重组单纯疱瘆病毒滴度的测定方法，其特征在该方法包括如下步骤: (I).在6孔板中的每个孔中加入细胞生长液，将传代病毒敏感细胞Vero加至到6孔板的孔中，待细胞密度达到70-90% ； (II).将病毒在磷酸盐缓冲液中稀释，制备?ο—1，?ο-2, ?ο-3, ?ο-4,10_5稀释度病毒接种液各 100yL ； (III).放置于培养箱0.8-1.2小时，再加入含0.8-1.2% Agarose的病毒生长液，铺匀待凝固，放入培养箱2天； (IV).选取长有20-200个空斑的孔皿进行空斑计数，通过公式得到原始病毒溶液感染滴度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中用到的是孔径为38.5mm的细胞培养皿或者细胞培养6孔板。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(I)中Ve1细胞生长密度达到.70-90%适合接种病毒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于做病毒梯度稀释时关键点是需要更换枪头O
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(III)中琼脂糖的终浓度为0.8-1.2%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(III)中2%琼脂糖溶液和病毒生长液要加热到41-43°Co
7.根据权利要求1所述的方法，2%琼脂糖溶液和病毒生长液是做等体积混合配成使用液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(IV)中适合于做病毒滴度定量的培养皿孔为长了 20-200个空斑的培养皿孔。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中，将传代病毒敏感细胞Vero加至到6孔板的孔中，放入36-38°C含5%0)2的细胞培养箱中24-26个小时，待细胞密度达到70-90% ;步骤(III)中，放置于培养箱0.8-1.2小时，再加入含0.8-1.2% Agarose的病毒生长液，铺匀待凝固，再将培养皿放入4.8-5.2% CO2的细胞培养箱，培养箱温度调到.34-36°C，放置 1.5-2.5 天。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于本发明所涉及到的试剂溶液配方如下: 磷酸盐缓冲液:.1.4 mM KH2PO4.8 mM Na2HPO4 . 140 mM NaCl . 2.7 mM KCl,pH 7.3 ； 细胞生长液: . 500mL MEM Medium . 100U/mL青霉素.lOOgg/mL链霉素.10% Fetal bovine serum琼脂糖溶液:.2g琼脂粉.10mL双蒸水；病毒生长液:.5OOmL MEM Medium.100U/mL青霉素.lOOPg/mL链霉素.0.2%牛血清白蛋白组分.25mM HEPES缓冲液.2Pg/mLTPCK-胰酶。
【专利摘要】一种重组单纯疱疹病毒滴度的测定方法，包括如下步骤：在6孔板中的每个孔中加入细胞生长液，将病毒在磷酸盐缓冲液中稀释，放置于培养箱0.8-1.2小时，再加入含0.8-1.2%Agarose的病毒生长液；选取长有20-200个空斑的孔皿进行空斑计数，通过公式得到原始病毒溶液感染滴度。本发明的优点：本发明不需要染色就可以确定病毒滴度的空斑实验法，使对重组单纯疱疹病毒滴度的定量时间周期短，操作简便，重复性好、材料设备要求低，可以在广大实验室和生产研发单位推广使用。
【IPC分类】C12Q1-70, C12R1-93
【公开号】CN104846120
【申请号】CN201510183396
【发明人】刘为勇, 王涛
【申请人】湖北创瑞生物科技有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年4月18日