肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒(荧光pcr法)的制作方法
【专利说明】肠道病毒71型和柯萨奇病毒Al 6型核酸检测试剂盒(荧光
PCR 法)
技术领域
[0001]本发明涉及核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，具体涉及一种一步法三色荧光PCR检测技术对患者咽拭子、粪便样本中肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)分型检测，利用内标质控体系监测反应体系可能存在的抑制因素的新方法。
【背景技术】
[0002]手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)是由肠道病毒引起的急性传染病，病毒以肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CA16)多见，多发生于学龄前儿童，尤以3岁以下年龄组发病率最高。感染手足口病初期，患者急性起病，发热、口痛、厌食、口腔黏膜出现散在疱瘆或溃疡，手、足、臀部、臂部、腿部出现斑丘瘆，后转为疱瘆；重症病例则可能出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等，极少数病例可致死亡。
[0003]对于肠道病毒引起的手足口病、病毒型脑炎等疾病实验室仍缺乏快速、敏感、特异的诊断方法。目前对于肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型引起的手足口病的实验室诊断方法主要有以下几个方面:1.病毒感染常规检查包括细胞和生化检查。2.病毒分离是肠道病毒实验室诊断的“金标准”。3.血清学检查比较患者急性期与恢复期血清中和抗体滴度，可作为EV71和CA16感染的血清学诊断方法。血清学检查不适用于早期诊断，可以作为回顾性诊断，如恢复期抗体水平比早期有多4倍上升，则有极大的诊断意义。肠道病毒(EV71和CA16)特异性核酸检测需要进行RT-PCR试验，并需要测序证实。虽然灵敏度较上述方法有所提高，但该方法是基于一对核酸引物进行扩增，容易产生非特异性扩增，出现假阳性。普通PCR技术的结果判读还需要对扩增产物进行凝胶电泳分析，操作繁琐、费时。
[0004]一步法三色荧光PCR检测技术原理是在单色荧光定量PCR技术的基础上，在同一个荧光定量PCR扩增实验中同时扩增三个目的基因，探针为多种荧光标记比如FAM、VIC、HEX、CY5、J0E等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。利用该原理发明的试剂盒在同一个标本的检测中，可以同时检测出肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型，并采用内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因素，实现对一个标本同时检测两种肠道病毒，并对病毒进行分型，应用极为方便。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，很大程度上增强了检测的灵敏度和特异性，避免了其它检测方法因特异性不高而易漏检的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，应用该试剂盒，可以对人体咽拭子、粪便样本中的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸RNA进行快速、准确测定，临床上主要用于肠道病毒感染的辅助诊断。
[0006]本发明提供一种肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，本试剂盒由核酸提取试剂盒及扩增试剂盒组成。核酸提取试剂盒包含磁珠、核酸助沉剂及RNA提取液；扩增试剂盒包含蛋白酶K、EV71/CA16 PCR反应液、EV71/CA16质控品、EV71/CA16内标，其中EV71/CA16 PCR反应液含有反转录酶、UNG酶、Taq酶、dNTP、MgCl2,EV71型引物、EV71型荧光探针、CA16型引物、CA16型荧光探针、内标引物、内标荧光探针。
[0007]检测用各引物、探针、质控品序列
1)检测用各分型上游引物和下游引物序列
EV71 型上游引物序列:5Λ-tgccgaaattggagcatcatcaaatg-3'
EV71 型下游引物序列:5Λ-actgggacatagatataacagg-3'
CA16 型上游引物序列:5Λ-gttgttcacgtatatgcgcttt_3'
CA16 型下游引物序列:5Λ-gattcattcgcttggcaaac_3'
内标上游引物序列:5Λ-aattggtcaacatgtgaaagc_3'
内标下游引物序列:5、gaatgtggccaaggttccgtcatttgg_3'
2)检测用各分型荧光探针序列和各自的荧光素标记物
EV71 型焚光探针序列:5'FAM_ccactcttgatagtttctttagtaggg_3'BHQ-1 CA16 型焚光探针序列:5'HEX_atggtgagctagtcccccaattac_3'BHQ-1 内标焚光探针序列:5ΛCY5_aatcttctaattactgtatatggaag_3'BHQ-2
3)质控品序列 EV71质控品序列:
teatcggctg gatacaggca aggttccagc actccaagct gccgaaattg gagcatcatcaaatgctagt gacgagagca
tgattgagac acgctgtgtc cttaactcgc acagtacagc tgagaccact cttgatagtttctttagtag ggcgggatta
gttggagaga tagatctccc tcttgagggc acaactaacc caaatggtta tgccaactgggacatagata taacaggttacgcgcaaatg cgtaCA16质控品序列:
tgctcaatta cggcgcaaat gcgagttgtt cacgtatatg cgctttgatg ctgaattcacatttgtcgta gccaagccca
atggtgagct agtcccccaa ttactgcagt acatgtatgt cccaccaggg gctccgaaacccacatccag agattcattc
gcttggcaaa ctgctaccaa cccatctgtg tttgtgaaaa tgacg
内标质粒序列:
aaaatctttt cttacaaggg aagtccccaa ttggtcaaca tgtgaaagca cgtgtcatgttcttactttt gtttgggtaa
tcttctaatt actgtatatg gaagatgtga atgaagttttggtcctgaat
gtggccaagg ttccgtcatt tggagatacg
aaatcaaatc tcctttaaga ttttgtttttataatgtgtt cttccatcc
EV71/CA16阴性质控品为无菌实验室三级水。
[0008]根据本发明的一个优选实施方案，其中检测肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和内标的荧光标记分别为FAM、HEX (VIC)、CY5，所以称为一步法三色荧光PCR检测技术。
[0009]根据本发明的一个优选实施方案，所述试剂盒中包括如下组分，
1)RNA提取液1:由Tris-HCl、SDS和GuSCN配制而成；
2)RNA提取液2:由EDTA和NaCl配制而成；
3)RNA提取液3:由Tris-HCl和乙醇配制而成；
4)RNA提取液4:由Tris-HCl分装而成；
5)RNA提取液5:由Tris-HCl、EDTA配制而成；
6)磁珠:为磁珠直接分装而成；
7)核酸助沉剂:为核酸助沉剂直接分装而成；
8)蛋白酶K:由蛋白酶K和灭菌的实验室三级水配制而成；
9)EV71/CA16PCR反应液:由RNA_mix、EV71上下游引物、EV71探针、CA16上下游引物、CA16探针、内标上下游引物、探针配制而成；
10)EV71/CA16阳性质控品:将一定量高浓度的EV71阳性质粒和CA16阳性质粒按照1:1的比例混合均匀，再用PH8.0的TE缓冲液稀释此混合质粒，至终浓度均为
1.00—9.99 X 106copies/mL ；
11)EV71/CA16弱阳性质控品:由一定量高浓度的EV71和CA16阳性混合质粒，pH8.0的TE缓冲液配制而成，使其终浓度均为1.00-9.99X 104copies/mL ；
12)EV71/CA16阴性质控品:为实验室三级水，经灭菌制成；
13)EV71/CA16内标:由一定量高浓度的内标质粒，pH8.0的TE缓冲液配制而成，使其终浓度为 1.00-9.99X 105copies/mLo
[0010]在优选的情况下，本发明使用磁珠法提取样本核酸，采用一步法三色荧光PCR检测技术，分别选取肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型基因组中相对保守的区域，设计特异性引物及探针，在样本核酸提取之后采用荧光PCR对病毒进行快速检测，同时采用内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。
[0011]具体的，在一个优选实施方案中，本发明所述方法包括如下步骤，①在生物样本中加入RNA提取液1、磁珠、蛋白酶K、核酸助沉剂、RNA提取液2，使样本裂解释放出RNA，RNA与纳米磁珠结合，在磁场作用下，磁珠聚集，磁珠-核酸复合物和液体分离向磁珠