用于蛋白质沉淀的共聚物的制作方法
【专利说明】用于蛋白质沉淀的共聚物
[0001] 本发明涉及使用共聚物从细胞培养液中提纯目标分子，如重组和/或生物治疗蛋 白质以便捕获或澄清化。根据本发明的方法使用的共聚物包含疏水残基和阴离子残基。
[0002] 发明背景 单克隆抗体(mAb)广泛用于临床用途、诊断系统和不同的研宄领域。自1986年生产首 个获批的mAb以来，利用哺乳动物细胞表达系统生产这些蛋白质已获得巨大发展。迄今，用 于mAb生产的主要是三种不同的细胞系：中国仓鼠卵巢（CH0)、小鼠骨髓瘤（NS0)和Sp2/0 细胞，同时在5000至25000升的生物反应器中进行生产。抗体和生物治疗蛋白质的下游 处理一般使用一系列提纯步骤，以收获发酵罐的产物(例如使用碟片式离心机（diskstack centrifuge))开始，接着通过深度过滤系统和膜过滤系统澄清化。此后，使用几个色谱分离 步骤，以最初使用亲和色谱法用蛋白质A捕获开始，接着是阴离子交换色谱法和阳离子交 换色谱法。另外的色谱分离步骤可包括疏水或亲水作用色谱法和尺寸排阻色谱法。通过低 ph洗脱实现病毒灭活，且附加的过滤除去残余病毒粒子。但是，与25年前的igr1相比如 今提高到i〇-i3gr1的细胞培养表达水平以及提高的经济压力需要与现有色谱基系统的性 能相比具有更高收率和吞吐量的增强的提纯方法。可通过提高色谱柱材料容量、柱尺寸或 开发对色谱法的替代提纯方法来满足这些需求，它们应该获得相当的收率和纯度，但降低 成本并且更好地规模化。对于大规模面积，已经开发出分批提纯法，其中从收获的细胞溶液 中沉淀出所需蛋白质。蛋白质沉淀的常用方法因此是硫酸按沉淀（AS) (Venkiteshwaran, Heider等人，2008)、聚乙二醇（PEG)沉淀或使用辛酸作为沉淀剂（Wang,Diehl等人， 2009;Temponi,Kageshita等人，1989)。但是，在大规模提纯中使用PEG或AS需要大量 的这些沉淀剂和更高的蛋白质浓度，仅产生中等纯度级，生成高废物负荷。现有提纯方法昂 贵、非常费力、具有大缓冲容积和低吞吐量(色谱法)或缺乏足够的纯度和收率(沉淀)。在低 pH下从蛋白质A中洗脱结合的mAb可形成免疫原性聚集体，除去它们和沥滤蛋白质A进一 步提高成本。因此，迫切需要对蛋白质A色谱法的替代方法以及对蛋白质和抗体提纯的改 进。另外，抗体的片段抗原结合区在诊断学和治疗中的应用越来越受关注。为了获得这样 的片段，可以使用内肽酶。用木瓜蛋白酶处理单克隆抗体是制造抗原结合片段或片段抗原 结合的常见方式，也导致生成Fc片段，代表抗体的恒定区。可以使用蛋白质A亲和色谱法 分离Fab和Fc，但是，由于蛋白质A与衍生自属于VH3亚家族的mAb的Fab的结合亲合力， 这种分离技术对这种类型的Fab而言无法胜任。人源化mAb极大依赖于具有VH3丰度的基 因序列。另外，人噬菌体展示库表现出VH3's的大量存在。因此，需要用于分离Fab和Fc片 段的替代策略。改性蛋白质A是一种选项，但相当成本密集。
[0003] 最近寻求的方法是使用聚合物作为沉淀剂，其可用于更大量的抗体而不需要定 制。
[0004] US6, 927, 282公开了具有不同电荷密度的阴离子聚合物用于聚合物絮凝的用途。 US5, 922, 531涉及用聚合电解质层处理的可控孔径玻璃（controlledporeglass)用于蛋 白质吸附的用途。WO2008/079280公开了使用在某些条件下可溶并在条件改变时从溶液中 沉淀出来的聚合电解质。
[0005] WO2008/091740公开了聚阴离子或聚阳离子聚合物用于蛋白质沉淀的用途。
[0006] 这表明使用聚合物作为沉淀剂的方法受到越来越多的关注。然而找出足够有效以 适用于生物制药生产的方法仍成问题。此外，对不同目标分子调节和优化该程序仍成问题。 [0007] 发明概沐 已经发现，具有阴离子性质和疏水性质的聚合物-所谓的阴离子混合型聚合物_ 是用于蛋白质沉淀的理想聚合物。通过使用包含疏水基团和阴离子基团的聚合物，可以以 高达90%的收率和更高的抗体回收率以良好纯度从澄清的细胞培养基中沉淀出抗体。
[0008] 本发明因此涉及一种从样品中分离或离析目标分子的方法，其包括： a) 提供所述样品 b) 将一种或多种包含疏水基团和阴离子基团的共聚物添加到所述样品中，由此形成 目标分子-共聚物沉淀物 c) 从步骤b)的混合物中分离沉淀物。
[0009] 在一个优选实施方案中，该共聚物包含35至65%阴离子基团。
[0010] 在一个优选实施方案中，该阴离子基团包含磺酸、硫酸、羧酸和/或膦酸或磷酸。
[0011] 在另一优选实施方案中，该疏水基团包含直链、支链或环状烷基、卤素取代的烷 基、芳基、杂芳基和/或卤素取代的芳基或杂芳基。
[0012] 在另一优选实施方案中，该共聚物具有10. 000至120. 000g/mol的重均分子量和 /或1，05-2, 50的多分散性。
[0013] 在一个优选实施方案中，该目标分子是抗体。
[0014] 在另一优选实施方案中，该目标分子是抗体的Fc(片段恒定区)部分或Fab(片段 抗原结合）区。
[0015] 在一个优选实施方案中，在步骤a)中，将该样品的pH调节到目标分子的等电点以 下和如果适用，应与其分离的该样品的其它组分的等电点以上的pH。
[0016] 在一个优选实施方案中，在步骤a)中，将该样品的pH调节到4至5. 5之间的pH。
[0017] 在另一优选实施方案中，将该样品的离子强度调节到在20°C下测得的类似于 17mS/cm或更低的电导率。
[0018] 在另一优选实施方案中，在附加步骤d)中，将来自步骤c)的沉淀物再溶解。
[0019] 在另一优选实施方案中，用二氧化硅或玻璃薄片处理步骤d)的再溶解混合物。
[0020] 在另一优选实施方案中，该二氧化硅或玻璃薄片用DMAE和/或TMAE基团官能化。
[0021] 附图 图1显示用于本发明的方法的共聚物的不同类型的合适结构单元的化学结构。
[0022] 图2显示作为光谱叠加的中红外光谱以比较 a) 已用本发明的提纯技术处理的单克隆抗体Cetuximab(西妥昔单抗） b) 未经沉淀的单克隆抗体Cetuximab的二级结构 并表明该抗体的二级结构在沉淀后没有明显改变。
[0023] 图3显示 a) 未沉淀的单克隆抗体 b) 用本公开的提纯技术处理的沉淀和再溶解的单克隆抗体 在生物层干涉测量（BLI)后的传感图， 其表明沉淀和未沉淀抗体的结合亲合力没有差异。红线代表将数据全局拟合到1:1相 互作用模型。使用Octet Red. Kinetics收集在含相同抗原的孔（6、4、3、2和1 nM)中测 得的未沉淀和沉淀抗体的数据。
[0024] 定义 在详细描述本发明之前，要理解的是，本发明不限于具体组成或方法步骤，因为这些可 变。必须指出，除非上下文清楚地另行规定，本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式 "一"、"一种"和"该"包括复数对象。因此，例如，提到"一配体"包括许多配体，提到"一抗 体"包括许多抗体，诸如此类。
[0025] 除非另行定义，本文所用的所有技术和科学术语具有如本发明所涉领域中的普通 技术人员通常理解的相同含义。如本文所述，为本发明的目的定义下列术语。
[0026] 本文所用的术语"目标分子"是指应与样品中的一种或多种其它组分，例如杂质隔 离、分离或提纯的任何分子、物质或化合物。目标分子的实例是抗体、抗原结合片段（Fab)、 片段恒定区（Fc)、蛋白质、肽、重组蛋白质、其它天然化合物、其它生物制药化合物、疫苗或 生物制药化合物的聚集体。在一个优选实施方案中，该目标分子是生物分子，优选蛋白质。 在一个非常优选的实施方案中，该目标分子是抗体。该目标分子通常是应通过采用本发明 的方法分离的产物，但也可以使用本发明的方法沉淀不是待分离的产物的目标分子。在这 种情况中，该目标分子是应除去的组分，而最终产物留在上清液中并通过除去目标分子来 提纯。当利用本发明提纯和分离Fab和Fc片段时，沉淀的目标分子例如可以是想要的产物， 但也可以