PCSK9 iRNA组合物及其使用方法
【专利说明】PCSK9iRNA组合物及其使用方法
[0001] 相关申请
[0002] 本专利申请要求于2012年12月5日提交的美国临时申请号61/733, 518、于2013 年3月15日提交的美国临时申请号61/793, 530、于2013年10月4日提交的美国临时申请 号61/886, 916、以及于2013年10月17日提交的美国临时申请号61/892, 188的优先权。 本申请还涉及2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561，710的优先权。将前述临 时专利申请每一者的全部内容特此通过引用结合在此。
[0003] 序列表
[0004] 本申请包括已经以电子方式以ASCII格式提交并且通过引用以其整体并入本文 中的序列表。创建于2013年10月29日的所述ASCII拷贝被命名为121301-00420_SL.txt， 大小为433, 512个字节。
[0005] 发明背景
[0006] 前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)是枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶 家族的一个成员。其他八种哺乳动物枯草杆菌蛋白酶蛋白酶PCSK1-PCSK8(也称为PC1/3、 PC2、弗林蛋白酶、PC4、PC5/6、PACE4、PC7、和S1P/SKI-1)是加工分泌途径中的很多种蛋白 质并且在多样的生物学过程中起作用的前蛋白转化酶（博格龙（Bergeron)F. (2000)《分 子内分泌杂志》（J.Mol.Endocrinol. )24,1-22,金斯伯格（Gensberg)K.，（1998)《细胞及 发育生物学讨论会文集》（Semin.CellDev.Biol. )9,11-17,赛义达（Seidah)N.G. (1999) 《大脑研宄》（BrainRes.) 848,45-62,泰勒（Taylor)N.A.，（2003)《美国实验生物学会联 合会杂志》（FASEBJ.) 17,1215-1227,以及周（Zhou)A.，（1999)《生物化学杂志》〇.81〇1. Chem.)274,20745-20748)。
[0007] 已经提出PCSK9在胆固醇代谢中起作用。类似于胆固醇生物合成酶和低密度脂 蛋白受体（LDLR)，PCSK9mRNA表达通过在小鼠中通过饲喂膳食胆固醇被下调（麦克斯韦 尔（Maxwell)K.N.，（2003)《脂质研宄杂志》（J.LipidRes.)44,2109-2119)，通过他汀类 药物在H印G2细胞中被上调（杜别克（Dubuc)G.，（2004)《动脉硬化、血栓形成和血管生物 学》（Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.) 24,1454-1459)，并且在固醇调节元件结合蛋白转 基因小鼠中被上调（SREBP)(霍顿（Horton)J.D.，（2003)《美国国家科学院院刊》（?1~〇(：. Natl.Acad.Sci.USA) 100,12027-12032)。此外，已经发现PCSK9错义突变与常染色体显性 高胆固醇血症形式（Hchola3)相关（阿比法德尔（Abifadel)M等人（2003)《自然遗传学》 (Nat.Genet.) 34,154-156,替姆斯（Timms)K.M., (2004)《人类遗传学》（Hum.Genet.) 114， 349-353,乐仁（Leren)T.P. (2004)《临床遗传学》（Clin.Genet. )65,419-422)QPCSK9还可以 在决定一般人群中的LDL胆固醇水平中起作用，因为单核苷酸多态性（SNP)与日本人的胆 固醇水平相关（正治（Shioji)K.，（2004)《人类遗传学杂志》（J.Hum.Genet. 49, 109-114)。
[0008] 常染色体显性高胆固醇血症（ADH)是单基因疾病，其中患者表现出升高的总胆固 醇水平和LDL胆固醇水平、肌腱黃色瘤、和早熟性动脉粥样硬化（雷德（Rader)D.J.，（2003) 《临床研宄杂志》（J.Clin.Invest.) 111，1795-1803)。ADH和隐性形式，常染色体隐性高 胆固醇血症（ARH)的发病机制（科恩（Cohen)J.C.，2003)《当代脂质视点》（Curr.Opin. Lipidol.)14，121-127)是由于经由肝脏的LDL摄取缺陷。ADH可以由阻止LDL摄取的LDLR突变引起，或者由在LDL上的蛋白质（结合LDLR的载脂蛋白）的突变引起。ARH由ARH蛋 白的突变引起，ARH蛋白对于经由它与网格蛋白的相互作用而内吞LDLR-LDL复合物是必需 的。因此，如果PCSK9突变是HChola3家族病的病因，那么PCSK9很可能在受体介导的LDL 摄取中起作用。
[0009] 过表达研宄指出PCSK9在控制LDLR水平并因此在控制经由肝脏的LDL摄取中 的作用（麦克斯韦尔（Maxwell)K.N. (2004)《美国国家科学院院刊》（?1~〇(3.似七1^〇&(1. Sci.USA) 101,7100-7105,本加内特（Benjannet)S?等人（2004)《生物化学杂志》（J.Biol. Chem.) 279,48865-48875,帕克（Park)S.W.，（2004)《生物化学杂志》（J.Biol.Chem.) 279， 50630-50638)。在小鼠中，腺病毒介导的小鼠或人PCSK9过表达3或4天导致总胆固醇水平 和LDL胆固醇水平的升高，而在LDLR敲除动物中未见到这种作用（麦克斯韦尔（Maxwell) K.N. (2004)《美国国家科学院院刊》（Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 101,7100-7105,本加内 特（Benjannet)S?等人（2004)《生物化学杂志》（J.Biol.Chem.) 279,48865-48875,帕克 (Park)S.W.，（2004)《生物化学杂志》（J.Biol.Chem.) 279, 50630-50638)。另外，PCSK9 过 表达导致肝脏LDLR蛋白的严重降低，但不影响LDLRmRNA水平、SREBP蛋白水平或SREBP蛋 白的细胞核/细胞质比例。
[0010] 虽然高胆固醇血症本身是无症状的，但是长期的血清胆固醇升高可导致动脉粥样 硬化。经过几十年，慢性升高的胆固醇促成动脉中动脉粥样硬化斑块形成，动脉粥样硬化可 导致涉及动脉的进行性狭窄或甚至完全闭塞。另外，更小的斑块可能破裂并引起凝块形成 和血流阻断，从而导致例如心肌梗死和/或中风。如果狭窄或闭塞的形成是逐渐的，那么到 组织和器官的血液供应缓慢地减少，一直到器官功能变得受损。
[0011] 因此，本领域中存在对用于PCSK9相关疾病（如高脂血症，例如高胆固醇血症）的 有效治疗的需要。
[0012] 发明概述
[0013] 如下文更详细地描述，在此披露了包含靶向PCSK9的RNAi剂例如双链iRNA剂的 组合物。还披露了使用本发明的组合物用于抑制PCSK9表达并且用于治疗与PCSK9表达相 关的病状例如高胆固醇血症的方法。
[0014] 因此，在一个方面，本发明提供了RNAi剂，例如双链RNAi剂，其能够抑制细胞中的 前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9 (PCSK9)的表达，其中该双链RNAi剂包含与反义链互 补的有义链，其中该反义链包含与编码PCSK9的mRNA的一部分互补的区域，其中每个链在 长度上为约14至约30个核苷酸，其中该双链RNAi剂由式（III)表示：
[0015] 有义链：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)厂Na-nq3'
[0016] 反义链：3，n/ -Na，-(X，X，X，）k-Nb，-Y，Y，Y，-V_(Z，Z，Z，） 1-V-V5， (III)
[0017] 其中
[0018] i、j、k和1各自独立地是0或1 ;
[0019] p、p'、q、和V各自独立地是0-6 ;
[0020] 凡和Na'各自独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡 核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
[0021] Nb和N/各自独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡 核苷酸序列；
[0022] 每个np、np'、nq、和nq'，其中每个可以是存在的或可以是不存在的，独立地表示 突出端核苷酸；
[0023]XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连 续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；
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