用于生产有机酸的重组微生物的制作方法
【专利说明】
[0001] 关于美国政府支持的声明
[0002] 本发明的方面是在美国政府的支持下根据拨款号DE-FC36-02G012001作出的。
[0003] 相关申请的交叉引用以及以电子方式递交的材料的以引用方式的并入
[0004] 本申请要求2012年10月2日提交的美国临时专利申请号61/708, 998的优先权， 该美国临时专利申请的公开内容特此以引用的方式整体并入本文。
[0005] 本申请含有作为本公开的单独部分的呈计算机可读形式的序列表（文件名： 40000A_SeqListing.txt，在2013年10月2日生成，20,065个字节），该序列表以引用的方 式整体并入本文。
技术领域
[0006] 本发明涉及被工程化以产生增加量的有机酸的微生物以及使用方法。
【背景技术】
[0007] 有机酸具有在诸如聚合物、食品、药物以及化妆品等多种工业应用中取代以石油 化学方式衍生的单体的潜能。使用基于生物的有机酸可以减小对化石燃料的依赖并且在减 少二氧化碳产生方面有益于环境。
【发明内容】
[0008] 本发明公开了用于生产有机酸的重组微生物。所公开的重组微生物表达酶葡萄 糖-6-磷酸-1-脱氢酶以及苹果酸脱氢酶，从而使得有机酸的产量增加。
[0009] 以下编号的段落各自简明地限定了本发明的一个或多个示例性变化方案：
[0010] 1. 一种重组微生物，所述重组微生物表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢 酶。
[0011] 2.段落1的重组微生物，其中所述重组生物体是产丁二酸微生物。
[0012] 3.段落1的重组微生物，所述重组微生物包含与琥珀酸放线杆菌 (Actinobacillus succinogenes)的16S核糖体RNA序列具有至少90%同一性的16S核糖 体RNA序列。
[0013] 4.段落1的重组微生物，所述重组微生物是琥珀酸放线杆菌、Bisgaard分类群 (Bisgaard Taxon)6 以及 Bisgaard 分类群 10。
[0014] 5.段落1至4中任一段落的重组微生物，所述重组微生物包含编码葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶的异源多核苷酸或过表达的多核苷酸以及编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸或 过表达的多核苷酸。
[0015] 6.段落1至5中任一段落的重组微生物，其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果 酸脱氢酶是琥珀酸放线杆菌酶。
[0016] 7.段落1至5中任一段落的重组微生物，其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果 酸脱氢酶是琥珀酸放线杆菌酶。
[0017] 8.段落1至6中任一段落的重组微生物，其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果 酸脱氢酶是大肠杆菌（E.coli)酶。
[0018] 9.段落1至5中任一段落的重组微生物，其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果 酸脱氢酶是大肠杆菌酶。
[0019] 10.段落1至5中任一段落的重组微生物，其中所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶包含与 SEQIDN0:2中所示出的氨基酸序列具有至少约40%序列同一性的氨基酸序列。
[0020] 11.段落1至5中任一段落的重组微生物，其中所述苹果酸脱氢酶包含与SEQID N0:4中所示出的氨基酸序列具有至少约60%序列同一性的氨基酸序列。
[0021] 12.段落1至11中任一段落的重组微生物，其中所述微生物与单独表达葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶的微生物相比产生增加量的有机酸（例如丁二酸）。
[0022] 13.段落1至12中任一段落的重组微生物，其中所述微生物能够产生约50g/L至 150g/L浓度的丁二酸。
[0023] 14. 一种用于生产有机酸的方法，所述方法包括在发酵培养基中培养段落1至13 中任一段落的重组微生物。
[0024] 15. -种生产有机酸的方法，所述方法包括在有利于产生有机酸的条件下使用碳 源培养重组微生物的步骤，其中所述重组微生物表达至少一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹 果酸脱氢酶。
[0025] 16.段落15的方法，其中所述重组微生物表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱 氢酶这两者。
[0026] 17. -种生产有机酸的方法，所述方法包括在有利于产生有机酸的条件下使用碳 源培养段落1至13中任一段落的重组微生物。
[0027] 18.段落15至17中任一段落的方法，其中所述有机酸是丁二酸或丙酸。
[0028] 19.段落18的方法，其中所述有机酸是丁二酸。
[0029] 20.段落15至19中任一段落的方法，其中所述碳源是葡萄糖或山梨糖醇。
【附图说明】
[0030] 图1描绘了 pL88载体的示意图。
[0031] 图2描绘了 pISTONSl的示意图。
[0032] 图3描绘了 p830. 60的示意图。
[0033] 图4描绘了 p856. 78的示意图。
[0034] 图5是来自大肠杆菌的Zwf酶的氨基酸序列（"查询"）与来自琥珀酸放线杆菌的 Zwf?酶的氨基酸序列（"sbjct"）之间的序列比较。
[0035] 图6是来自大肠杆菌的Mdh酶的氨基酸序列（"查询"）与来自琥珀酸放线杆菌的 Mdh酶的氨基酸序列（"sbjct"）之间的序列比较。
[0036] 图7是来自黄曲霉（Aspergillusflavus)的Mdh酶的氨基酸序列（"查询"）与 来自琥珀酸放线杆菌的Mdh酶的氨基酸序列（"sbjct"）之间的序列比较。
[0037] 图8是p830. 60中的琥珀酸放线杆菌zwf核酸序列。
[0038] 图9是pISTONSl中的琥珀酸放线杆菌mdh核酸序列。
【具体实施方式】
[0039] 在以下【具体实施方式】中，实施方案被足够详细地描述以使得本领域技术人员能够 实施这些实施方案，并且应当理解的是，也可以利用其它实施方案并且可以进行化学上的 和程序上的变化而不背离本发明主题的精神和范围。以下【具体实施方式】因此不应被视作具 有限制性的意义，并且实施方案的范围仅由所附权利要求书限定。
[0040] 术语"微生物"指的是单细胞生物体，如细菌、真菌或酵母。
[0041] 术语"重组微生物"指的是如下的微生物，所述微生物经过改变、修饰或工程化 (例如遗传工程化）以使它与产生它的天然存在的微生物或起始微生物相比表现出改变、 改造或不同的基因型或表型（例如在遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时）。
[0042] 遗传操作可以包括但不限于改变或修饰与特定基因的表达有关的调节序列或位 点（例如通过使用强启动子、诱导型启动子或多重启动子）；修饰特定基因的染色体位置； 改变靠近特定基因的核酸序列，如启动子区域中包括对于启动子活性来说重要的调节序列 的序列、核糖体结合位点、或转录终止子；增加特定基因的拷贝数；修饰涉及特定基因产物 的转录或翻译的蛋白质（例如调节蛋白、抑制因子、增强因子、转录激活因子等）；或任何其 它提高特定基因的表达的常规手段。
[0043] 如本文所用的"有机酸"包括包含至少一个羧基的酸。任选地，所述有机酸是(^-(：1(| 有机酸，还任选地，所述有机酸包含两个羧基。举例来说，"有机酸"包括丁二酸或丙酸。有 机酸的其它实例包括但不限于乳酸、苹果酸、柠檬酸、草酸以及酒石酸。如本文所用的有机 酸还可以包括有机酸阴离子或其盐。举例来说，"丁二酸"可以被称为"丁二酸盐"；"丙酸" 可以被称为"丙酸盐"。
[0044] "异源"指的是并非源于需要表达的特定细胞或生物体或并非是需要表达的特定 细胞或生物体原生的任何多核苷酸或多肽。
[0045] "过表达"指的是多核苷酸表达而产生比该多核苷酸通常在宿主细胞中表达的水 平更高的水平的产物（例如多肽或RNA)。过表达的多核苷酸一般是宿主细胞原生的多核苷 酸，所述多核苷酸的产物以比通常存在于宿主细胞中的量大的量产生。过表达是通过例如 而不限于使多核苷酸与和所述多核苷酸的原生启动子不同的启动子可操作地连接或将该 多核苷酸的另外的拷贝引入到宿主细胞中来实现。
[0046] "源自于"生物体的多肽或多核苷酸包含与来自该生物体的参考多肽或多核苷酸 相同的氨基酸序列或核酸序列，或任选地相对于原生氨基酸序列或核苷酸序列含有一处或 多处修饰，如下文进一步所述，并且任选地与原生酶相比即使没有表现出更好的活性，也表 现出相似的活性（例如原生酶的活性水平的至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至 少100%、或至少110% )。将了解的是，"源自于"生物体的多肽或多核苷酸不限于以物理 方式从特定的宿主生物体中取出的多肽或多核苷酸。
[0047] 此外在本文中，由端点表述数值范围时，包括该范围内所包括的所有数字（例如1 至5包括1、1. 5、2、2. 75、3、3. 80、4、5等）。此外，公开范围时，包括公开了更宽范围内所包 括的所有子范围（例如1至5公开了 1至4、1. 5至4. 5、4至5等）。
[0048] 本发明提供了用于经由发酵生产有机酸的经过改进的材料和方法。发酵性能通常 通过以下三个参数来获得：滴度、生产率以及收率。滴度表示在发酵结束时发酵液中产物 (例如有机酸，如丁二酸）的浓度。生产率或生产速率表示达到产物滴度的时间。收率是产 物的质量/原料（例如糖，如葡萄糖）的质量的商数。所有这三个参数均影响发酵生产工 艺的经济情况。高滴度有助于产物回收；必须蒸发或去除更少的水，从而需要更少的能量， 这会降低工艺的操作成本。生产率与滴度相关联，为滴度增添了时间维度。高生产率意味 着快速的发酵工艺，并且允许缩减发酵容器的尺寸，这是因为可以更频繁地运行该工艺。生 产率主要影响发酵生产工艺的资金成本。收率影响该工艺的操作成本，即收率越高，则获得 产物所需的原材料或原料越少。
[0049] 滴度、生产率以及收率相互交织并且相互影响。在短时间内实现高滴度的发酵将 产生高生产率，反之亦然。发酵产物的积聚或更高的滴度可以使生产减慢。收率与生产率呈 负相关，这是因为在发酵中不仅使用原料来支持生物体生长、细胞繁殖以及构筑生物质，而 且还使原料代谢成所需的产物。一般来说，更多的细胞将产生更多的产物并且将更快地产 生产物，从而将使得生产率更高，但会使得收率更低。因此，发酵优化必须使所有这三个参 数平衡以实现最为经济的工艺。最终的目标在于实现所有这三个参数的值均较高的工艺。
[0050] 值得注意的是，发现在如本文所述的重组微生物（例如琥珀酸放线杆菌）中磷酸 戊糖途径（或ED途径（Entner-Doudoroffpathway))和三羧酸循环中的酶同时过量产生 以促进更高收率的丁二酸，所述收率是确定发酵工艺的经济可行性的关键因素。在这方面， 本发明至少部分地以如下惊人的发现为基础：在微生物中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸 脱氢酶的产生使得有机酸的产量与由单独表达单一酶的微生物所实现的产量水平相比有 所提高。磷酸戊糖循环（或ED途径）利用多种酶，包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（例如葡萄 糖-6-磷酸-1-脱氢酶，它也被称为间酶（