一种基因工程重组甲戊肝炎联合疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于用基因工程制备疫苗的方法。
技术背景
[0002]在公共卫生中，甲型肝炎和戊型肝炎是一种主要的传染性疾病，该疾病具有经粪一口传播的相同途径，以成年人尤其是老年人和孕妇作为相似的易感人群和疫苗受种人群。与甲型肝炎和戊型肝炎对应的甲肝病毒(HAV)和戊肝病毒(HEV)都是小RNA病毒，目前，两种疾病都有单价疫苗。其中，甲肝疫苗主要是病毒灭活疫苗和减毒活疫苗，而戊肝疫苗是基因工程疫苗，抗原成分为原核表达的戊肝病毒0RF2 C端抗原表位。
[0003]Guu TS等采用的中和抗原位于0RF2 C端的P2结构域454_end是最重要的病毒中和位点，且在P2结构域上有3个取向朝外的、高度保守的环AA482 - 490，550 - 566，and 583 - 593，即与病毒-抗体结合有关(Guu TS, Liu Z, Ye Q, et al.Structure ofthe hepatitis E virus-like particle suggests mechanisms for virus assembly andreceptor binding.Proc Natl Acad Sci USA.2009.106(31): 12992-7.)。该基因工程表达的P2结构域可形成具有良好免疫原性的类病毒颗粒(Virus Like Particle，VLP)。联合疫苗是疫苗研宄的发展方向，提供甲戊肝炎二者联合疫苗的重要意义在于:联合疫苗具有简化免疫程序、减轻受种者精神和经济负担，降低漏种率，利于两种疾病的预防与控制。传统的联合疫苗开发思路是将两种现有疫苗进行联用，急剧增高了疫苗成本，也无法解决两种疫苗之间的配伍问题。
[0004]Gerardo等人的研宄表明，在HAV基因组的2A-2B连接区及5’非编码区可以容纳 600nt 以内的外源基因片段(Konduru K, Nakamura SM, Kaplan GG.Hepatitis
A virus (HAV) packaging size limit.Virol J.2009.6: 204.)，并能随病毒复制，表达外源蛋白，该发现为开发以甲肝病毒为载体的重组联合疫苗奠定了基础。
[0005]董晨等人的研宄结果表明甲肝灭活疫苗能增强戊肝基因工程疫苗的免疫原
性(Dong C，Dai X, Meng JH.The first experimental study on a candidatecombined vaccine against hepatitis A and hepatitis E.Vaccine.2007.25(9):1662-8.)o我们的前期研宄发现甲戊嵌合抗原能形成类病毒颗粒(VLP)，有效诱导了抗HAV和 HEV 的中和抗体(Kui X, Sun M, Xie T, et al.The express1n, purificat1n,and immunogenicity of a new chimeric virus-like particle.Viral Tmmunol.2009.22(1): 49-56.)，这一研宄结果为开发甲戊重组疫苗奠定了坚实基础。
【发明内容】
[0006]本发明旨在提供一种基因工程重组甲戊肝炎联合疫苗的制备方法，该方法以携带戊肝抗原表位基因的重组甲肝病毒作为甲戊肝炎联合疫苗的基础，使戊肝抗原以基因的形式存在于甲肝病毒基因组中，并随甲肝减毒株在体内的复制而表达，较好地配伍两种不同疫苗。
[0007]同时，本发明不改变甲肝疫苗生产方法而生产甲戊肝炎联合疫苗，生产成本低。
[0008]本发明上述目的通过以下制备方法实现，包括以下步骤:
(1)将HAV逆转录出全长CDNA插入在携带T7启动子的转录载体上，并在
其2A-2B连接区的3C蛋白酶切位点后面按顺序构建3甘氨酸肽链ggtggcgga、多克隆位点gtcgactacgtaactagt以及额外的3C蛋白酶切位点氨基酸肽链LFSQA编码序列，该LFSQA编码序列可以是3C蛋白酶切位点对应所有同义密码子的任意组合，插入的辅助序列排列如下:
ggtggcgga gtcgactacgtaactagt ggtggaggc LFSQA 编码序列；
(2)将HEV核心抗原0RF2基因插入HAV基因组的2A-2B连接区所构建的多克隆位点处，得到嵌合了 HEV 0RF2抗原表位基因的HAV全基因组转录载体；
(3)体外转录，产生重组HAVRNA:
a、使用限制性核酸内切酶在转录载体的HAV基因组下游线性化质粒模板；
b、使用体外转录试剂盒对线性化的模板进行转录，产生重组HAVRNA ;
(4)酚氯仿抽提纯化体外转录的重组HAVRNA ；
(5)由脂质体介导重组HAVRNA转染HAV易感细胞，拯救重组HAV病毒，进行扩增；
(6)重组HAV病毒鉴定。
[0009]所述的方法进一步是:步骤(I)所述的多克隆位点gtcgactacgtaactagt是在转录载体和HEV核心抗原编码序列中不含有的限制性核酸内切酶位点的序列。
[0010]所述的方法进一步是:步骤(I)所述的额外的3C蛋白酶切位点氨基酸肽链LFSQA的最优选编码序列是HAV基因组自有序列，该序列为ctgttttcacaagcc。
[0011]所述的方法进一步是:步骤(2) HEV核心抗原的优选序列为0RF2 aa 431-615。
[0012]所述的方法进一步是:步骤(5)由脂质体介导重组HAV RNA转染HAV易感细胞拯救重组HAV病毒，包括:
无双抗培养基培养至90%汇合率的HAV易感细胞细胞用DMEM洗2次；加入Opt1-MEM37°C孵育30分钟；纯化的RNA 8ug加入Opt1-MEM至250ul为溶液I ;Lip2000加入Opt1-MEM至250ul为溶液II ;将溶液I滴入溶液II混合为溶液III，室温孵育5min ;将混合液III滴加入含Opt1-MEM的HAV易感细胞细胞，37°C孵育5_6小时；更换培养基为无双抗的生长液；3天后更换生长液为维持液，每5天换液I次；4周后冻融超声收获重组HAV病毒。
[0013]所述的方法进一步是:步骤(5)其扩增是将拯救所得的重组HAV病毒与HAV病毒易感细胞37°C吸附2h后，补加维持液，再置于35°C培养28天收毒，期间每5_7天更换一次维持液。
[0014]所述的方法任意之一种是:由脂质体介导重组HAV RNA转染的HAV易感细胞是Huh7 或 vero 或 KMB17 或 C0S-7 或 FRhK-4。
[0015]本发明具有的积极效果是:
当本发明重组的甲戊肝炎联合的减毒活病毒进入人体后，随着重组HAV在体内的复制，HEV开放读码框2—HEV 0RF2 aa 431-615基因也将得到表达。这是由于外源基因两端为3C蛋白酶切位点，当3C蛋白酶对HAV结构多肽进行剪切加工的同时，也将HEV外源肽从2A-2B连接区释放，该释放使得甲肝病毒的装配不受外源肽的影响。同时，释放出的HEV抗原肽能在真核细胞中正确折叠，形成天然的构象表位肽。由于HEV外源肽以基因的形式存在于重组HAV病毒基因组中，随重组HAV减毒株在体内的复制而表达，避免了两种不同疫苗的配伍问题。本发明拯救出的重组病毒进行重组HAV病毒鉴定结果如图2、3，其病毒滴度检测符合《中国生物制品规程》(2000年版)甲型肝炎减毒活疫苗制造及检定规程中的细胞培养法(CCID5tl)测定要求。
[0016]本发明在不改变甲肝疫苗生产方法的情况下即可生产甲戊肝炎联合疫苗，较传统的联合疫苗，可显著降低生产成本。
【附图说明】
[0017]图1是携带戊肝抗原基因的HAV体外转录产物。A为RNA分子量marker，B为重组 HAV RNA0
[0018]图2是重组HAV 2A — 2B区的特异RT-PCR鉴定的特异条带。A为DNA分子量marker, B为插入HEV 0RF2抗原基因的重组HAV病毒基因组2A-2B区特异性条带，C为没有插入HEV 0RF2抗原基因的HAV病毒2A-2B区特异性条带。
[0019]图3?8是HAV特异性免疫荧光。其中:图3、4和5为重组HAV病毒感染的Huh7细胞同一视野下的不同成像。图6、7和8为没有感染HAV病毒的Huh7细胞对照在同一视野下的不同成像。
[0020]图3为特异性抗HAV免疫荧光，一抗使用兔抗HAV特异性抗体，二抗使用红色荧光标记的抗兔IgG，可见感染细胞胞浆有特异性荧光产生。
[0021]图4为4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染。
[0022]图5为图3和4的叠加合成图。
[0023]图6为特异性抗HAV免疫荧光对照，一抗及二抗与图3使用一致，可见对照细胞胞浆无特异性荧光产生。
[0024]图7为4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染。
[0025]图8为图6和7的叠加合成图。
[0026]图9?14是HEV特异性免疫荧光。其中，图9、10和11为重组HAV病毒感染的Huh7细胞同一视野下的不同成像；图12、13和14为没有感染HAV病毒的Huh7细胞对照在同一视野下的不同成像。
[0027]图9为特异性抗HEV 0RF2免疫荧光，一抗使用兔抗HEV 0RF2特异性抗体，二抗使用红色荧光标记的抗兔IgG，可见感染细胞胞浆有特异性荧光产生。
[0028]图10 为 DAPI 复染。
[0029]图11为图9和10的叠加合成图。
[0030]图12为特异性抗HEV 0RF2免疫荧光对照，一抗