热稳定碱性果胶酶突变体及其编码基因以及它们的应用

文档序号:8539214阅读:325来源:国知局
热稳定碱性果胶酶突变体及其编码基因以及它们的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种果胶酶蛋白,所述果胶酶蛋白的编码基因,含有该编码基因的重 组载体和转基因细胞,含有所述果胶酶蛋白作为活性成分的组合物,以及如上所述的果胶 酶蛋白、编码基因、重组载体、转基因细胞和组合物在水解果胶中的应用。
【背景技术】
[0002] 果胶质是一种酸性多糖物质,广泛存在于植物界,主要存在于植物的细胞初生壁 和细胞中间层,为内部细胞的支撑物质。果胶的化学结构复杂,果胶的主链是部分甲酯 化的半乳聚糖,支链依据果胶质来源的不同而改变。去酯化的果胶被称作果胶酸或者多 聚半乳糖醛酸。水解这类果胶物质的酶被广泛称作果胶酶。内切聚半乳糖醛酸裂解酶 (EC. 4. 2. 2. 2)是通过β消除作用随机裂解果胶酸的α-1,4-糖苷键将其降解。碱性果胶 酶可应用于一些传统的工业过程,如纺织和植物纤维处理、咖啡和茶业发酵、油料提取、含 有果胶物质的工业废水处理。由于微生物酶法在生物精炼及植物纤维脱胶等处理过程比传 统的化学处理具有明显的优势,它能够减少化学处理过程中采用高浓度的强碱溶液对植物 纤维的损害及后期污水的处理,因而也引起越来越多的研究。
[0003] 酶学特性和酶的稳定性是影响其应用的关键因素之一。由于脱胶的过程多数是在 碱性和较高温度条件下进行的,也就要求了参与这过程中的酶要必须要能耐受较高的温度 和碱性。其中酶的热稳定性对于工业应用来说十分重要,而且高温条件下,酶的反应速度更 快,能缩短反应周期,节约成本,也有利于避免反应过程中被其他微生物污染。
[0004] 从嗜碱芽孢杆菌BaciIIus sp. Ν16-5 (CGMCC N0.0 369)克隆得到的果胶酶 Bspl65PelA具有活性高,最适反应pH高,同时它并不需要额外添加 Ca2+就能保持活性,在 生物脱胶等方面具有较大的工业应用潜力,但由于其热稳定性不理想,50°C保温30min就 基本丧失了活性,提高其热稳定性具有重要意义。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是为了克服现有果胶酶不能够耐高温的缺陷,提供了一种耐高温的 果胶酶蛋白及其编码基因,另外,还提供了含有编码所述果胶酶蛋白的基因的重组载体、细 胞,以及含有所述果胶酶蛋白的组合物,以及它们的应用。
[0006] 为了实现上述目的,一方面,本发明提供了一种果胶酶蛋白,其中,所述果胶酶蛋 白的氨基酸序列如SEQ ID No :5或SEQ ID No :6所示。
[0007] 第二方面,本发明提供了一种编码基因,其中,所述编码基因能够编码如上所述的 果胶酶蛋白。
[0008] 第三方面,本发明提供了一种重组载体,其中,所述重组载体含有如上所述的编码 基因。
[0009] 第四方面,本发明提供了一种转基因细胞,其中,所述转基因细胞含有如上所述的 编码基因。
[0010] 第五方面,本发明提供了一种组合物,其中,所述组合物含有如上所述的果胶酶蛋 白作为活性成分。
[0011] 第六方面,本发明提供了如上所述的果胶酶蛋白、如上所述的编码基因、如上所述 的重组载体、如上所述的转基因细胞、如上所述的组合物在水解果胶中的应用。
[0012] 通实施例可以看出,本发明提供的果胶酶蛋白的热稳定性能明显得到了提高。
[0013] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0014] 附图是用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明,但并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0015] 图1显示了果胶酶蛋白突变体以及野生型果胶酶蛋白在50°C下保温不同时间的 残余酶活。
【具体实施方式】
[0016] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
[0017] 第一方面,本发明提供了一种果胶酶蛋白,其中,所述果胶酶蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No :5 (表示为 2B9)或 SEQ ID No :6 (表示为 EA)所示。
[0018] 根据本发明,所述果胶酶蛋白的来源没有特别的限制,只要能够获得如上氨基酸 序列的果胶酶蛋白即可。例如,所述果胶酶蛋白可以由人工合成获得,也可以通过该果胶酶 蛋白的氨基酸序列获得其编码基因,然后再进行相应的生物表达获得。
[0019] 基于此,本发明提供了一种编码基因,其中,所述编码基因能够编码如上所述的果 胶酶蛋白。
[0020] 本领域技术人员公知,遗传密码子具有简并性,因此,在了解如上果胶酶蛋白的氨 基酸序列的情况下,本领域技术人员根据常规的技术手段能够获得核苷酸序列不同的、且 能够编码如上果胶酶蛋白的编码基因。
[0021] 优选的情况下,编码SEQ ID No :5的基因的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示、编码 SEQ ID No :6的基因的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示。
[0022] 其中,编码野生型果胶酶蛋白SEQ ID No :4 (表示为WT)的基因的核苷酸序列如 SEQ ID No :1 所示。
[0023] 第三方面,本发明提供了一种重组载体,其中,所述重组载体含有如上所述的编码 基因。
[0024] 第四方面,本发明提供了一种转基因细胞,其中,所述转基因细胞含有如上所述的 编码基因。
[0025] 所述转基因细胞优选为原核细胞,更优选为大肠杆菌。
[0026] 根据本发明,本发明提供的转基因细胞可以用于所述果胶酶蛋白的制备,具体地, 所述转基因细胞可以为大肠杆菌,可以在35-40°C的条件下进行培养,当OD值达到0. 6左右 时,加入诱导剂继续培养4-6小时。所述诱导剂通常为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),其终浓 度例如可以为0. 8-1. 2mM。
[0027] 第五方面,本发明提供了一种组合物,其中,所述组合物含有如上所述的果胶酶蛋 白作为活性成分。
[0028] 根据本发明,所述组合物中所述果胶酶蛋白的浓度没有特别的限制,可以根据具 体的情况进行具体的选择,在此不再详细赘述。
[0029] 另外,根据预定的用途不同,本发明提供的组合物可以制备为不同的剂型,并且添 加有相应的赋形剂等成分。具体的选择为本领域技术人员所公知,在此不再详细赘述。
[0030] 第六方面,本发明提供了如上所述的果胶酶蛋白、如上所述的编码基因、如上所述 的重组载体、如上所述的转基因细胞、如上所述的组合物在水解果胶中的应用。
[0031] 以下通过实施例进一步详细说明本发明。
[0032] 下列实施例中未注明具体条件的试验方法,按照常规条件进行,例如《分子克隆: 实验室手册》中所述的条件,或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。
[0033] 实施例1
[0034] 易错PCR方法构建果胶酶突变文库
[0035] 首先采用 PCR 方法(pelA 上游引物序列为:5' -GTGCGCTAGCATGGGACG-3',如 SEQ ID No :9 所示;pelA 下游引物序列为 5' -GCGAAGCTTTCATCGATTTG-3',如 SEQ ID No :10 所示)从嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp. N16-5 (CGMCC N0.0 369)基因组扩增获得果胶酶 Bspl65PelA基因 pelA,构建重组质粒pET28a-pelA。再以pET28a-pelA为模板,利用易错 PCR技术在体外向pelA引入核苷酸突变。随机突变引物序列为如SEQ ID No :7 (MegaF : 5'-GCGGCAGCCATATGGCTAGCT-3^PSEQIDNo:8(MegaR:5'-GCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTC-3) 所示。
[0036] 扩增体系为:
[0037]
【主权项】
1. 一种果胶酶蛋白,其特征在于,所述果胶酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No :5或SEQ ID No :6 所示。
2. -种编码基因,其特征在于,所述编码基因能够编码权利要求1所述的果胶酶蛋白。
3. 根据权利要求2所述的编码基因,其中,所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No: 2 或 SEQ ID No :3 所示。
4. 一种重组载体,其特征在于,所述重组载体含有权利要求2所述的编码基因。
5. -种转基因细胞,其特征在于,所述转基因细胞含有权利要求2所述的编码基因。
6. 根据权利要求5所述的转基因细胞,其中,所述转基因细胞为原核细胞。
7. -种组合物,其特征在于,所述组合物含有权利要求1所述的果胶酶蛋白作为活性 成分。
8. 权利要求1所述的果胶酶蛋白、权利要求2所述的编码基因、权利要求4所述的重组 载体、权利要求5所述的转基因细胞、权利要求7所述的组合物在水解果胶中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种果胶酶蛋白,其中,所述果胶酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:5或SEQ ID No:6所示。另外,本发明还提供了含有该编码基因的重组载体和转基因细胞,含有所述果胶酶蛋白作为活性成分的组合物,以及如上所述的果胶酶蛋白、编码基因、重组载体、转基因细胞和组合物在水解果胶中的应用。本发明提供的果胶酶蛋白具有较高的热稳定性和活性。
【IPC分类】C12N15-63, C12N1-21, C12N15-60, C12N9-88
【公开号】CN104862295
【申请号】CN201410067267
【发明人】马延和, 叶金统, 周成, 薛燕芬
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2014年2月26日
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