一种提高枯草芽孢杆菌外源蛋白表达量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物诱变育种、发酵工程及酶学领域。具体涉及一种结合ARTP诱变育种提高枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)外源蛋白表达量的方法。
【背景技术】
[0002]B.subtilis是一种产芽孢的革兰氏阳性菌，具有较清晰的遗传背景、良好的蛋白分泌能力和一系列高效的信号肽。与常用的原核表达宿主E.coli相比，B.subtilis不含内毒素、具有非致病性，是一种食品级微生物，可用于食品发酵和重要酶制剂的生产。此夕卜，B.subtilis长期被用于生产蛋白酶和淀粉酶，其所需的培养条件非常简单。因此，B.subtilis是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白的理想宿主。
[0003]高效表达的重组宿主诱变筛选常采用空宿主(不含重组质粒)进行诱变后，构建突变文库。将重组质粒转化突变文库，构建含有重组质粒的突变文库，再进行下一步筛选。但这种方法，往往存在转化效率偏低等缺点(特别是对于B.subtilis宿主)，会导致大量具有良好性能的突变体的遗失。为解决上述问题，本发明在诱变时采用含有重组质粒的B.subtilis菌株直接诱变，省去了诱变后重组质粒的转化步骤(B.subtilis菌株重组质粒转化困难)，具有高效性。
[0004]目前，提高重组菌外源蛋白表达量的方法，除了传统的物理化学诱变、发酵过程优化及重组质粒调控元件的优化外，近几年发展起来一种新型的生物诱变育种技术一常压室温等离子体(ARTP)诱变技术，该诱变育种系统的核心部件是裸露金属电极结构的大气压射频辉光放电等离子体发生器，所产生的活性粒子有电子、光子、离子、处于激发态的中性粒子及一些自由基。这些活性粒子会一定程度上作用于细胞的核酸和蛋白质，从而引起基因及微生物细胞结构及通透性的改变，导致微生物发生突变。与传统的物理化学诱变及离子束注入技术相比，该诱变技术具有设备简单，操作简便、安全，突变率高、突变文库容量大等优点。此外，等离子体源产生的活性粒子温度接近室温，作用条件温和，避免了某些对热敏感的微生物受到的热损伤。
[0005]关于高产异源蛋白突变株的筛选方法主要是随机筛选法或平板菌落预筛法。缩小筛选范围后，采用摇瓶初筛对突变株逐个进行发酵培养并测定淀粉酶酶活，该筛选方法周期长且工作量大、降低了高产突变株的获得概率。基于ARTP诱变技术的高突变率，结合96孔板高通量的筛选法，可大大提高获得高产突变株的效率，因此该技术可广泛应用于微生物的诱变育种中。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种提高枯草芽孢杆菌外源蛋白表达量的方法。
[0007]为实现上述目的，本发明所用的技术方案为:
[0008]本发明采用ARTP诱变育种技术对含有重组质粒的B.subtilis菌株进行直接诱变，获得重组B.subtilisl68突变体文库。通过比对淀粉-台盼蓝营养平板产生的透明圈大小进行预筛，缩小筛选范围，然后提供了一种基于96孔板的高通量筛选方法，高效的得到高产碱性淀粉酶的B.subtilis 168突变株。最后通过摇瓶复筛验证筛选到的高产突变株的发酵产酶能力，对高产菌株所含的重组质粒进行测序验证并对重组菌株进行遗传稳定性验证。
[0009]具体包括以下步骤:
[0010]出发菌的活化:将含有重组质粒的重组B.subtilis 168于新鲜LB固体培养基中划线，于25?37°C下培养10?20h，接单菌落至新鲜LB液体培养基中，25?37°C培养8?24h后，按20?60%接种量转接新鲜LB培养基，进行同步培养；
[0011]ARTP诱变:用无菌生理盐水洗涤菌体I?5次后重悬菌体，并适当稀释菌体浓度至16?9个/mL,取2?15 μ L均匀涂于无菌载片上，置于处理源下2?6_，开始诱变处理；
[0012]突变菌株后培养:将诱变后的菌液，立即放入新鲜的LB液体培养基中，进行I?4h后培养，适当稀释菌体浓度至16?9个/mL，均匀涂布于新鲜的LB (Kana抗性)平板上培养8?16h ；
[0013]外源蛋白高产突变株筛选(本专利以碱性淀粉酶为例):将步骤(3)中诱变获得重组B.subtilis 168突变体文库中的突变体，用无菌牙签逐个点种于淀粉-台盼蓝营养平板上，每块平板上点种2?4个出发株做对照，25?37°C培养6?12h后观察透明圈大小，其中比出发株菌落小透明圈大的可能为高产碱性淀粉酶突变株；缩小筛选范围后，进行96孔板高通量筛选，最后进行摇瓶发酵验证。
[0014]重组宿主中重组质粒验证:提取含有目的外源蛋白的重组质粒，进行基因测序，验证重组质粒本身是否突变；
[0015]高产突变株遗传稳定性的验证:将摇瓶验证获得的高产突变株，连续传代3?10次，测碱性淀粉酶酶活是否稳定。
[0016]步骤(2)中所述的洗涤后的菌体重悬于生理盐水，然后适当稀释，使OD_在1.0?
3.0之间，确保产生的活性粒子能够均匀作用于菌体。步骤(2)中ARTP诱变处理的参数设置为:气流量8?16slm、射频功率80?140W、时间20?50s、距处理源距离2?6_。经等离子体诱变后，后培养I?4h，使产生的突变更加稳定。
[0017]步骤(4)中产生的含有碱性淀粉酶基因的重组B.subtilis 168突变体文库，逐个点种于淀粉-台盼蓝营养平板进行预筛，通过透明圈的大小筛选高产重组酶突变株，然后进行96孔板高通量筛选，获得少量高产突变体，最后采用摇瓶发酵验证高产突变菌株。该步骤中所用的淀粉-台盼蓝营养培养基成分及含量为:可溶性淀粉0.5?1.5%、台盼蓝0.01 ?0.06%、NaCl 0.5 ?1.5%、Yeast Extract 0.2 ?0.8%、Tryptone 0.5 ?2.0%、琼脂1.5?2.5%，121°C灭菌15min。筛选平板中卡那霉素的工作浓度为30?60 μ g/mL。
[0018]步骤(4)中摇瓶发酵验证所用的种子培养基为LB培养基，25?37°C培养8?12h后，按1.0?4.0%的接种量接种于发酵培养基中。摇瓶发酵培养基成分为:可溶性淀粉0.1 ?1.5%、大豆蛋白胨 0.5 ?3.0%、豆饼粉 0.5 ?3.0%、NaCl 0.5 ?1.5%，121°C灭菌15min。装液量为15?60mL/250mL，发酵温度为30?37°C，发酵培养时间为48?80h。高通量筛选采用96孔板，每孔装液量400?1000 μ L，所用发酵培养基其成分及配制步骤为:先配磷酸缓冲液，称取1.5?3.0g KH2PO4和10.0?15.0g K2HPO4,定容至10mL ;YeastExtract 18.0 ?30.0g、Tryptone 8.0 ?16.0g,甘油 2.0 ?6.0mT,,溶于 QOOmT,水中；灭菌，待磷酸缓冲液冷却至50?60°C时，加入900mL培养基中，摇匀，待用。
[0019]步骤(5)中验证高产突变株的遗传稳定性，将摇瓶验证获得的高产突变株，连续传代3?10次，测碱性淀粉酶酶活力是否稳定。
【附图说明】
[0020]图196孔板高通量筛选结果
[0021]图2突变株mut-16#与出发株酶活力比较
【具体实施方式】
[0022]为了对本发明有更深入的了解，现结合附图和具体实例对本发明做进一步的说明。
[0023]实施例1:利用常压室温等离子体诱变B.subtilis 168
[0024]将出发株重组B.subtilis 168在新鲜LB平板进行划线、活化培养，挑取单菌落于新鲜LB液体培养基中，250mL锥形瓶培养，卡那霉素的工作浓度为50 μ g/mL,转速200rpm。培养结束后，转接新鲜L