羟化酶基因Dr2473在微生物催化合成中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一种在类胡萝卜素类次生代谢产物合成过程中 发挥羟化酶功能的新型基因。
【背景技术】
[0002] 次生代谢产物是由次生代谢产生，以初级代谢产物为前体的一类细胞生命活动生 长发育正常运行非必需的小分子有机化合物。微生物次生代谢产物因其结构与活性的多样 性在医药和农业生产上具有广泛的用途。
[0003] 类胡萝卜素类化合物是一类主要由植物或微生物合成的次生代谢产物，具有抗氧 化活性，在生物体中表现为猝灭单线态氧，清除自由基，阻止脂质过氧化等功能。类胡萝卜 素类化合物，因其具有的抗氧化特性被作为食品色素、饲料添加剂和药品化妆品中的活性 成分使用。同时还能够被用于功能性食品和药品中的原料成分抵抗退化性疾病，如癌症、皮 肤相关病症和心脏疾病等。
[0004] 耐辐射异常球菌被公认为是迄今发现的具有最强电离辐射抗性和氧化抗性的生 物。其能够合成结构特异的类胡萝卜素-异常叶黄素（(2R)-2，r -二羟-3'，4' -二脱 氢-Γ，2' -二氢-β，_胡萝卜素-4-酮）。该化合物Beta-环末端增加了 C-2位羟基取 代。在目前确定的类胡萝卜素化合物中，这种C-2位羟基单环氧化类胡萝卜素是异常球菌 属特有的，并且不同于其他报道的C-3羟基化类胡萝卜素。
[0005] 在耐辐射异常球菌中，已经发现并鉴定了一系列参与胡萝卜素合成过程功能酶类 的编码基因，但Beta环C-2位关键羟化酶基因还未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是从耐福射异常球菌Deinococcus radiodurans中发现一种用于芳 香环羟基化的羟化酶基因。
[0007] 本发明通过如下研宄，首次发现耐辐射异常球菌Dr2473基因 （GeneID :1800296 ; ProteinID :NP_296193. 1)可用于微生物化合物生物合成。具体研宄工作如下：
[0008] 1、获得含有Dr2473基因的重组工程菌株
[0009] 1)通过PCR从耐辐射异常球菌基因组扩增出Dr2473基因，基因序列号为： GeneID !GeneID :1800296。其大小为1146bp，该基因编码382个氨基酸，将其克隆于载体 PJET上，构建了含有完整Dr2473基因的重组质粒pJET-2473 ;
[0010] 2)将Dr2473基因连接于pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌中都起作 用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整Dr2473基因重组质粒pRADZ3-2473 ;
[0011] 3)将导入Dr2473基因的重组质粒pRADZ3-2473转入受体大肠杆菌JM109中，获得 工程菌株JM-2473 (详见实施例1);
[0012] 2、含有Dr2473基因重组工程菌株的化合物合成检测实验
[0013] 实验证实，向培养基中添加类胡萝卜素类底物化合物后，含有嗜热异常球菌 Dr2473基因的JM-2473重组菌株能够将底物化合物进一步加工，在Beta环2或2'位点进 行羟基化反应。
[0014] 此实验表明：耐辐射异常球菌Dr2473基因具有在微生物中催化类胡萝卜素类化 合物Beta环2或2'位点进行羟基化反应的作用。
[0015] 序列表信息
[0016] SEQ ID NO. I :Dr2473 基因的 DNA 序列。
[0017] SEQ ID NO. 2 :Dr2473 的氨基酸序列。
【附图说明】：
[0018] 图1工程菌株JM-2473与对照菌株JM-Z3的产物化合物的HPLC分析。图中，A对 照菌株JM-Z3的产物峰型图；B工程菌株JM-2473的产物峰型图；
[0019] 图2底物化合物的质谱分析。A为底物1号化合物质谱解析图；
[0020] 图3产物化合物的质谱分析。B为产物2号化合物质谱解析图。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化羟基化的对象只用于对本发明作 进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照 本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌 株来源如下：
[0022] 克隆载体p JET :为ThermoFisher公司市售产品；
[0023] 穿梭质粒pRADZ3 :为本实验室保存；
[0024] 大肠杆菌JM 109 :为北京全式金公司市售产品。
[0025] 类胡萝卜素底物由本申请人实验室分离自耐辐射异常球菌；
[0026] 名称是 2-deoxy deinoxanthin，结构如下：
[0027]
【主权项】
LSEQ ID NO: 1所示序列的基因在微生物催化生物合成中的应用。
2. 权利要求1所述的应用，是作为羟化酶在生物合成中用于芳香环的羟基化反应。
3. 权利要求2所述的应用，所述羟基化反应是类胡萝卜素进行环的羟基化反应。
4. 权利要求1所述的应用，所述微生物是原核生物。
5. 权利要求1所述DNA序列编码的氨基酸序列，如SEQ ID NO: 2所示。
【专利摘要】本发明从耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans中发现了一种具有羟化酶功能的基因。本发明构建了含有该基因的重组载体，将其在原核宿主细胞大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，能催化类胡萝卜素进行羟基化反应，可用于微生物催化生物合成。
【IPC分类】C12P23-00, C12N15-53, C12N9-02
【公开号】CN104862324
【申请号】CN201510296770
【发明人】张维, 周正富, 徐玉泉, 柯秀彬, 陈明
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月2日