L-苏氨酸基因工程生产菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种L-苏氨酸基因工程生产 菌。
【背景技术】
[0002] L-苏氨酸作为人类和动物必需的八种氨基酸之一，在人和动物的生长发育中起着 重要的作用，L-苏氨酸被广泛用于饲料添加剂、食品工业及医药产品等方面。
[0003] L-苏氨酸的合成主要由蛋白质水解法、化学合成法、酶法和发酵法，前三种方法都 由于存在着种种弊端，不能满足工业生产的目的。而直接发酵法由于成本低、污染小等优 点，已被作为合成L-苏氨酸的主要方法。
[0004] 上世纪50年代，日本最早采用添加前体物的方法发酵生产苏氨酸，至60年代已有 直接发酵法合成L-苏氨酸的报道，是利用诱变育种的方法改造的黄色短杆菌直接发酵生 产L-苏氨酸。上世纪70年代末，苏联已开始用基因工程菌大规模生产L-苏氨酸。
[0005] 传统多用诱变黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌等，解除菌体自身的反馈调节，切断之 路代谢，增加前体物的合成等，以提高L-苏氨酸产量。Shiio(Isamu Shiio and Shigeru Nakamori. Agr Bio Chem. 1969, 33 (8) : 1152)等利用黄色短杆菌，经α -氨基-β -羟基戊酸 处理后，获得了 L-苏氨酸生产菌株，苏氨酸测产量累积13. 58g/L。Nakamori等（Shigeru Nakamori and Isamu Shiio. Agr Bio Chem. 1972, 36(7) :1209)在此菌株基础上，选育出了 L-蛋氨酸缺陷型变异株，产量提高到了 18g/L。但传统诱变育种由于随机性较强，获得高产 突变株的难度较大。
[0006] 利用合理的代谢工程的方法构建L-苏氨酸工程菌，是目前获得高产菌株的首选 方法。2002年日本味之素申请的中国专利CN01137078. 5中，利用大肠杆菌，通过增强苏氨 酸合成代谢途径上相关基因的表达，苏氨酸产率达〇. 43g/g (葡萄糖，糖酸转化率为43% )， 但发酵过程中需要额外添加 L-甲硫氨酸。Kwang Ho Lee (Kwang Ho Lee, Jin Hwan Park, Tae Yong Kim, et al. Mol Syst Biol. 2007 ;3:149)等利用代用代谢工程手段，将编码天冬氨酸 激酶I和III的thrA和IysC基因突变，解除了末端产物反馈抑制；同时失活tdh和突变 ilvA基因使苏氨酸不被降解；失活metA和IysA基因，为苏氨酸合成提供了更多前体，最终 通过分配发酵培养，产酸率为0. 393g/g (葡萄糖，糖酸转化率为39. 3 % )，但发酵过程中需 要添加 L-蛋氨酸和L-赖氨酸，增加了工业化生产成本。
【发明内容】
[0007] 本发明利用基因工程技术改造大肠杆菌，通过增强相关基因，弱化分支代谢途径， 获得一株高产L-苏氨酸的生产菌株，发酵过程中不需要添加任何氨基酸，能有效的积累 L-苏氨酸，生产成本低，具有广泛的工业应用前景。
[0008] 因此，本发明的第一个目的在于提供一种L-苏氨酸基因工程生产菌的构建方法。
[0009] 本发明的第二个目的在于提供一种L-苏氨酸基因工程生产菌。
[0010] 本发明的第三个目的在于提供一种L-苏氨酸的生产方法。
[0011] 本发明的第四个目的在于提供所述L-苏氨酸基因工程生产菌用于生产L-苏氨酸 的应用。
[0012] 为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0013] 根据本发明的第一个方面，一种L-苏氨酸基因工程生产菌的构建方法，包括以下 步骤：
[0014] A、敲除原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲 除的基因选自：tdh、tdcC和thrL中的一个或多个；
[0015] B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因 增强菌株，所述增强的基因选自：thrA*BC(G433R)和rhtC中的一个或多个；
[0016] C、构建包含过表达原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所 述过表达的基因选自ppc、aspA、pntAB和thrA*(G433R)，lysC*(T342I)中的一个或多个；
[0017] D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤A中所述基因敲除菌株和/或步骤B中所述 基因增强菌株中，获得L-苏氨酸基因工程生产菌。
[0018] 根据本发明的优选实施例，所述L-苏氨酸基因工程生产菌的构建方法，包括以下 步骤：
[0019] A、敲除原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因敲除菌株，所述敲 除的基因为tdh、tdcC和thrL ;
[0020] B、增强步骤A中所述基因敲除菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因，获得基因 增强菌株，所述增强的基因为thrA*BC(G433R)和rhtC ;
[0021] C、构建包含过表达原始菌株中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因的重组质粒，所 述过表达的基因为 ppc、aspA、pntAB 和 thrA* (G433R)，IysO (T342I);
[0022] D、将步骤C中所述重组质粒导入步骤B中所述基因增强菌株中，获得L-苏氨酸基 因工程生产菌。
[0023] 根据本发明，所述原始菌株为大肠杆菌。
[0024] 根据本发明的优选实施例，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。
[0025] 根据本发明的第二个方面，按照如上所述方法构建获得的L-苏氨酸基因工程生 产菌。
[0026] 根据本发明的优选实施例，所述的L-苏氨酸基因工程生产菌，保藏号为CCTCC NO: M 2015233。
[0027] 根据本发明的第三个方面，一种L-苏氨酸的生产方法，通过发酵如上所述的L-苏 氨酸基因工程生产菌生产。
[0028] 根据本发明的优选实施例，所述发酵的发酵培养基组成如下：葡萄糖30g/L， NaCl 0· 8g/L，（NH4) 2S0422g/L，Κ2ΗΡ042· Og/L，MgSO4 · 7H20 0· 8g/L，MnSO4 · 5Η200· 02g/L， FeSO4 · 7H20 0· 02g/L，盐酸硫胺 0· 002g/L，酵母粉 1.0 g/L，CaC0330g/L，ρΗ7· 0。
[0029] 根据本发明的额第四个方面，如上所述的L-苏氨酸基因工程生产菌可用于生产 L-苏氨酸。
[0030] 本发明所构建的L-苏氨酸基因工程菌能够实现发酵过程中发酵液中L-苏氨酸的 有效积累，提高了 L-苏氨酸的产量及糖酸转化率，发酵过程中不需要添加任何氨基酸，具 有广泛的工业应用前景。
【附图说明】
[0031] 图1为重组质粒pThr的示意图，过表达ppc、aspA、pntAB和thrA* (G433R)基因。
[0032] 图2为苏氨酸基因工程菌的产量和糖酸转化率示意图。
【具体实施方式】
[0033] 以下