糊精分子量特征在检测淀粉液化效果上的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及淀粉深加工领域，尤其是涉及一种基于糊精分子特征评价淀粉液化效 果的方法。
【背景技术】
[0002] 淀粉质原料在发酵之前需先经α -淀粉酶水解液化，将大分子切割成短链，形成 糊精和少量寡糖，从而使淀粉的黏度下降，为糖化酶的作用创造条件。在当前普遍应用的液 化工艺中，主要使用商品α -淀粉酶，依据制造商提供的通用化反应条件对淀粉质原料进 行液化。然而以上液化条件的设置，往往只考虑了酶制剂针对某种特定底物的催化效率和 稳定性，而没有顾及淀粉水解反应链的其他步骤以及不同发酵产品相异的发酵过程。尤其 在我国特有的粗料发酵模式中体现出发酵过程不稳定的特点，这是长期制约发酵行业提升 的关键技术问题。
[0003] 另一方面，黑曲霉糖化酶是一种外切型淀粉酶，它针对不同结构的底物作用效率 不同。Jennylynd A研宄发现黑曲霉糖化酶作用于长链的活性更大。进一步地，Κ. Hiromi 研宄发现黑曲霉糖化酶对低聚糖的Km值随着DP (DP < 7)的增加而降低，对麦芽糖的Km值 为0. 18~I. 4mM，而对麦芽低聚糖的Km值为0. 02~0. 14mM。
[0004] 为了提升淀粉的糖化效率，需要对液化过程实施理性控制，全面科学地表征液化 程度就显得十分必要。当前发酵行业中普遍使用DE值（dextrose equvialent value)作 为液化评价指标。然而DE值无法真实反映糊精混合物的糖分组成和分子量分布，不足以作 为判断液化效果的依据。传统的碘试法检测液化终点又具有精确度低和波动性大的局限。 基于全面科学表征的精细化控制液化程度是粗料发酵模式，乃至整个淀粉深加工行业亟待 解决的关键技术问题。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种糊精分子量特征在检测淀粉 液化效果上的应用。本发明考察糖化酶催化特性与糊精结构的关系，能够全面科学表征淀 粉液化程度，实现淀粉质原料液化过程精细化控制；改善淀粉液化质量，进而提高糖化效 率，提升以淀粉质为原料的粗料发酵模式，同时有助于带动淀粉深加工产业；凡提及基于糊 精分子量特征评价液化效果的方法，均适用本发明技术。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 糊精分子量特征在检测淀粉液化效果上的应用，具体步骤如下：
[0008] (1)在待测淀粉液化液中分离制备不同分子量分布的糊精组分；
[0009] (2)以步骤（1)制备的糊精组分为底物，进行糖化酶的酶促反应动力学实验，比较 不同分子量糊精组分的Km值，以亲和力最高即Km值最小的底物分子量特征为评价指标，评 价淀粉质原料液化效果。
[0010] 所述待测淀粉液化液通过常规方法制备。所述待测淀粉液化液的常规方法制备 为：将淀粉溶解在水中，用0.1mol/LNaOH调节pH至5. 8~6. 0,然后加入高温α -淀粉酶， 其添加量为10~30U/g淀粉，得到混合液；将步骤得到的混合液置于99°C超级恒温水浴槽 中，搅拌均匀，经碘试合格，得到液化液，然后进行灭酶。
[0011] 所述不同分子量分布的糊精组分通过常规方法分离制备。所述不同分子量分布的 糊精组分的常规方法分离制备为：取待测淀粉液化液，加入乙醇，调节至乙醇终浓度30% (v/v)，置于4°C冰箱中静置24h，离心，沉淀经过相应浓度乙醇洗涤，低温干燥获得组分1 ; 上清液中缓慢添加乙醇调节至乙醇终浓度为30% (v/v)，置于4°C冰箱中静置24h，离心，沉 淀经过相应浓度乙醇洗涤，低温干燥获得组分2 ;如此重复上述操作，得到不同分子量分布 的糊精组分。
[0012] 所述碘试合格为浅棕色。
[0013] 本发明有益的技术效果在于：
[0014] 本发明针对传统液化过程DE值作为评价液化效果，DE值无法真实反映糊精混合 物的糖分组成和分子量分布，不足以作为判断液化效果的依据，提供一种基于糊精分子特 征评价淀粉液化效果的方法。
[0015] 本发明基于淀粉液化糊精分子的组成单元相同（均为葡萄糖残基）；其受糖化酶 催化水解的效率因分子量而异。因此，糊精的分子量可作为表征液化程度的可靠指标。为 了在糊精分子量表征下控制液化程度，从而提高糖化效率，需要以糖化酶作用于不同分子 量糊精时的动力学参数为依据。本发明相比于现有技术所具有的优点有：
[0016] (1)基于黑曲霉糖化酶的催化特性与糊精结构的关系，通过对糊精结构的精确表 征有助于实现淀粉质原料液化组分精细化控制；
[0017] (2)能够克服传统评价方法不能真实反映糊精混合物的糖分组成和分子量分布的 缺陷，能够全面科学表征液化程度，实现液化过程理性控制；
[0018] (3)改善液化质量，进而提高糖化效率，带动以淀粉质为原料的粗料发酵模式，同 时有助于提升淀粉深加工产业。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
[0020] 称取40g玉米淀粉于烧杯中；加入200mL去离子水（常温）混合均匀，用0· Imol/ L NaOH调节pH至5. 8~6. 0 ;添加高温α -淀粉酶1200U，搅拌均匀。置于99°C超级恒温 水浴槽（配备磁力搅拌装置）中，搅拌均匀，碘试为浅棕色合格；立即用〇· lmol/L HCI调节 pH至3.0,灭酶终止反应，平衡5min后，用0. lmol/L NaOH中和，调节pH至中性。将淀粉水 解液稀释，配置成质量浓度为7% (w/w)的糊精溶液。
[0021] 取糊精溶液100mL，缓慢加入乙醇，并不断搅拌，调节至乙醇终浓度30% (v/v)，置 于4°C冰箱中静置24h，离心（4°C，10000g，20min)，沉淀经过相应浓度乙醇洗涤，低温干燥 获得组分1 ;上清液中缓慢添加乙醇调节至乙醇终浓度为30% (v/v)，置于4°C冰箱中静置 24h，离心（4°C，lOOOOrpm，20min)，沉淀经过相应浓度乙醇洗涤，低温干燥获得组分2 ;如此 重复上述操作，调节至乙醇终浓度为70 % (v/v)，分别获得1~5醇沉组分，经体积排阻色 谱测定不同组分分子量分布。
[0022] 基于体积排阻色谱法对糊精组分分析，计算糊精分子量，获得5个糊精组分分子 量信息如下：糊精I (即组分1，下同）重均分子量为21kDa ;糊精2重均分子量为12kDa ;糊 精3重均分子量为5. 6kDa，；糊精4重均分子量为I. 9kDa ;糊精5重均分子量为I. 4kDa
[0023] 分别考察糊精组分与酶促反应动力学特征，结果如表1所示。从表1中可以看出， 糖化酶对应不同分子量糊精的Km值是不同的，即糖化酶与不同分子量糊精亲和力是不同 的，Km值越低即亲和力越高则液化效果越好。由此可以说明，糊精分子量特征可以用于评 价淀粉液化效果。
[0024] 表1不同分子量糊精酶促动力学参数
[0025]
【主权项】
1. 糊精分子量特征在检测淀粉液化效果上的应用，其特征在于具体步骤如下： (1) 在待测淀粉液化液中分离制备不同分子量分布的糊精组分； (2) 以步骤（1)制备的糊精组分为底物，进行糖化酶的酶促反应动力学实验，比较不同 分子量糊精组分的Km值，以亲和力最高即Km值最小的底物分子量特征为评价指标，评价淀 粉质原料液化效果。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述待测淀粉液化液通过常规方法制备。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述不同分子量分布的糊精组分通过常规 方法分离制备。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述待测淀粉液化液的常规方法制备为： 将淀粉溶解在水中，用〇. Imol/LNaOH调节pH至5. 8~6. 0,然后加入高温a -淀粉酶，其添 加量为10~30U/g淀粉，得到混合液；将步骤得到的混合液置于99°C超级恒温水浴槽中， 搅拌均匀，经碘试合格，得到液化液，然后进行灭酶。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述不同分子量分布的糊精组分的常规方 法分离制备为：取待测淀粉液化液，加入乙醇，调节至乙醇终浓度30% (v/v)，置于4°C冰箱 中静置24h，离心，沉淀经过相应浓度乙醇洗涤，低温干燥获得组分1 ;上清液中缓慢添加乙 醇调节至乙醇终浓度为30% (v/v)，置于4°C冰箱中静置24h，离心，沉淀经过相应浓度乙醇 洗涤，低温干燥获得组分2 ;如此重复上述操作，得到不同分子量分布的糊精组分。
6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述碘试合格为浅棕色。
【专利摘要】糊精分子量特征在检测淀粉液化效果上的应用，具体步骤如下：(1)在待测淀粉液化液中分离制备不同分子量分布的糊精组分；(2)以步骤(1)制备的糊精组分为底物，进行糖化酶的酶促反应动力学实验，比较不同分子量糊精组分的Km值，以亲和力最高即Km值最小的底物分子量特征为评价指标，评价淀粉质原料液化效果。本发明考察糖化酶催化特性与糊精结构的关系，能够全面科学表征淀粉液化程度，实现淀粉质原料液化过程精细化控制；改善淀粉液化质量，进而提高糖化效率，提升以淀粉质为原料的粗料发酵模式，同时有助于带动淀粉深加工产业；凡提及基于糊精分子量特征评价液化效果的方法，均适用本发明技术。
【IPC分类】C12Q1-40
【公开号】CN104862375
【申请号】CN201510324346
【发明人】石贵阳, 王宝石, 李由然, 胡志杰, 蒋小东, 孙福新, 张 杰, 张梁, 丁重阳, 李赢, 顾正华
【申请人】江南大学, 江苏国信协联能源有限公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月12日