水稻上两种种传病害的多重pcr检测试剂盒及其专用引物和多重pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及两种植物病原的分子生物学检测技术领域，具体涉及到水稻白叶 枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)和细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)的多重分子生物学检测方法。
【背景技术】
[0002] 我国是农产品贸易的第四大进口国和第五大出口国，经济全球化的趋势下使我国 对外贸易的进一步扩大，植物及其产品的调运日趋频繁，同时也带来了较为严重的有害生 物的入侵威胁，这己经成为危害我国生物多样性、生态环境和国民经济的一个十分重要和 紧迫的问题。现如今，我国的水稻种子产业市场相比于东南亚以及南美等主要水稻生产国 相比，优势较明显，不论品种类别还是贸易方式都逐渐趋于多样化。但是由于经济利益的驱 动，一些不法商贩私自生产，经营水稻种子。这不仅严重的损害了我国种子出口的质量和信 誉，也导致了伪劣，带毒或者不适合区域种植条件的种子流入市场。各出入境口岸及产地植 物病害检验检疫迫切要求高效灵敏、快捷简便的诊断技术及工具，以加强口岸检疫，构筑防 范外来疫害入侵的第一道屏障，对保障我国农业生产安全，服务于农产品的出口和国内贸 易具有重大的现实意义。
[0003] 本发明所述的水稻上两种种传病害是指分别由水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)引起的水稻白叶枯病和由水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)引起的水稻细菌性条斑病。
[0004] 水稻白叶枯病是由水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)引起的一 种水稻的重要检疫性种传病害。其菌体呈短杆状，单胞，单鞭毛，极生或亚极生，无芽 抱，无英膜，菌体外具粘质的胞外多糖包围，革兰氏染色阴性，好气性。在肉汁胨琼脂培 养基培养基上菌落蜜黄色或淡黄色，圆形，周边整齐，质地均匀，表面隆起，光沿发亮， 粘性，产生非水溶性的黄色素。病菌生长最适温度为25-30°C，最低5°C，最高40°C，在 无胶膜保护下53°C 10分钟致死，有胶膜保护下57°C 10分钟致死。病菌最适宜酸碱度为 ρΗ6· 5-7. 0〇
[0005] 该种病菌又称白叶瘟、地火烧、茅草瘟等。水稻的整个生育期均可被害，尤其苗期、 分穗期受害最重，各个器官均可染病，叶片最易染病。且该病菌不仅会附着在种子表面有 时还会寄存在种子内部。其症状因病菌侵入部位、品种抗病性、环境条件有较大差异，常见 的主要有叶枯型、急性凋萎型、褐斑或褐变型3种类型：
[0006] ( -）叶枯型，主要为害叶片，严重时也为害叶鞘，发病先从叶尖或叶缘开始，先 出现暗绿色水浸状线状斑，很快沿线状斑形成黄白色病斑，然后沿叶缘两侧或中肋扩展， 变成黄褐色，最后呈枯白色，病斑边缘界限明显。
[0007] (二）急性凋萎型，从苗期到分孽期，病菌从根系或茎基部伤口侵入维管束时易发 病。并且主茎同时发病，心叶失水青枯，凋萎死亡，其余叶片也先后青枯卷曲，然后全株 枯死，也会有仅仅心叶枯死的情况。
[0008] (三）褐斑或褐变型，在抗病品种上较多见，病菌通过人工剪叶或伤口侵入，在气 温低或不利发病条件，病斑外围出现褐色坏死反应带时，会停滞扩展。
[0009] 黄化型症状较不多见，其主要表现在早期心叶不枯死，且会产生不规则褪绿斑， 在染病后期会发展为枯黄斑。
[0010] 该病菌作为一种水稻重要检疫性种传病害，危害仅次于水稻细菌性条斑病，在我 国除新疆、西藏和西南稻区以外，各大产区均有发生，云南省就有105个县发生此病。该病 对产量影响较大，产量减少达20% -30%，严重时可达50% -60%，甚至颗粒无收。一般籼 稻伤害重于粳糯稻，晚稻伤害重于早稻。其寄主除水稻外，还包括陆稻，野生稻，菱白和李 氏禾为自然寄主植物，但这些植物上发病不甚常见。除此之外还有菱白和李氏禾属的鞘糠 草，批壳草，千金子和蛆子草等。
[0011] 目前，水稻白叶枯病自1884年在日本发生以来，相继在亚洲、欧洲、大洋洲、非洲 和北美洲均有发现。其发生范围己遍及全球水稻栽培地区，在世界各国有记载发病的国家 就有日本，美国，中国等27个国家其中以日本，印度以及中国发病较为严重。
[0012] 水稻条斑病菌属于原核生物界（Procaryotes)，薄壁细菌门（Gracilicutes)， 黄单胞菌科黄单胞菌属（Xanthomonas)的稻黄单胞菌。病菌大小约为1.0-2. 5 μπι或 0. 4-0. 6 μ m。单胞偶尔成对，但不成链状，不形成芽孢和荚膜，具有端生单鞭毛，能游动，无 孢子，无荚膜。革兰氏染色反应阴性，生长最适温度为25 - 28°C，致死温度为51°C。在肉 汁胨琼脂培养基上病原菌生长快，菌落常呈淡黄色，圆形，光滑，边缘规则，圆顶状，粘稠状， 好气。该病菌与水稻白叶枯病菌的致病性和表现性状虽有很大不同，但其遗传性状及生理 生化性状又有很大相似性，故该菌应作为稻白叶枯病菌种内的一个变种。
[0013] 细菌性条斑病，又称细条病、条斑病。是由细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)引起的一种水稻的重要检疫性种传病害。主要为害水稻叶片以及幼龄叶片。 从苗期到抽穗期都会发生，但以分蘖期到抽穗前期发病为多。且该病菌不仅会附着在种子 表面有时还会寄存在种子内部。病斑局限于叶脉间薄壁细胞，初为深绿色水浸状半透明小 点，很快在叶脉间向上下扩展，成为淡黄色狭条斑，由于受叶脉限制病斑不宽，少数情况 下病菌能越过叶脉横向扩展。抗病品种上病斑很短，大小约1x10mm，感病品种上病斑较长， 有时可达30-50mm.或更长，许多病斑可连成大块枯死斑。病斑两端呈浸润型绿色。病斑上 常溢出大量串珠状黄色菌脓，干后呈胶状小粒。白叶枯病斑上菌溢不多不常见到，而细菌 性条斑上则常布满小珠状细菌液。除水稻外，还有澳洲稻、阔叶稻、菱白以及许多野生稻等 均可受侵染而发病，如 Oryza latifolia, Oryza brachyantha, Oryza breviligulate 等。 近年来在长江流域杂交晚稻上亦有大面积发生。水稻细菌性条斑病对籼稻的危害性最大， 已上升为华南、中南稻区上的主要细菌病害。
[0014] 目前，水稻细菌性条斑病主要分布在热带和亚热带地区，如菲律宾、泰国、印度 等，从地区分布来看，主要集中在亚洲和非洲。在我国水稻细菌性条斑病主要分布在南方 省区，如广东、贵州、云南、四川、浙江、江西、湖南、湖北等。
[0015] 2007年，我国农业部颁布了《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名 录》，公布了包括有害昆虫、软体动物、真菌、原核生物、线虫和病毒等，共435种有害生 物。其中侵染水稻作物的种传病害主要是水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae)等。这两种病菌不仅 都能侵染水稻作物并且都能通过带菌种子进行远距离传播.以及借风雨、灌溉水和昆虫传 播以及农事操作的刀具、器皿等进行近距离.导致农产品产量下降，极大的阻碍了我国农 业发展.
[0016] 目前，症状观察是进行植物病原检测常用的一种方法，症状观察法是通过直接观 察植物受害部位的病状特征以达到检测的目的。病状类型主要有：萎蔫，斑点溃疡，软腐 病，畸形和疮痂等。症状观察时着重注意的是发病的部位、症状变化的范围及不同发病个体 之间症状特征的比较，但是有的病害发病特征却极其相似，仅凭肉眼难以区分，当两种或 以上病害侵染同一植株时也难以辨别.比如水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌仅凭 肉眼难以区分，在复合侵染时仅凭症状观察更难以区分。
[0017] 显微镜观