辣椒萎黄病病毒检测引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于一种基于DNA体外扩增技术的植物病毒分子生物学检测方法，涉及 针对布尼亚病毒科（Bunyaviridae)、番前斑萎病毒属（Tospovirus)的辣椒萎黄病病毒 (Capsicum Chlorosis Virus)的检验检疫和分子生物学研宄领域。
【背景技术】
[0002] 目前，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR)技术(参见美国专 利4, 683, 195、4, 683, 202、4, 965, 188)在分子生物学研宄和检测技术领域的应用非常普遍， 相关技术资料可以参考分子克隆-实验手册（Molecular Cloning-A Laboratory Manual， Cold SpringHarbor，New York)等文献。
[0003] 辣椒萎黄病病毒（Capsicum Chlorosis Virus，CaCV)感染前科植物，花生，蝴蝶兰 (Phalaenopsis)等，是严重危害兰花养殖业的RNA植物病毒之一。CaCV最先由台湾学者发 现感染蝴蝶兰，并很快被欧洲、澳大利亚等国列入兰花贸易待检病毒清单。CaCV最主要的病 征是在受到侵害的植株叶面位置产生黄化轮斑，但它并不导致全株植物组织带毒。CaCV可 以但不易通过机械接种、嫁接、组织切片等方式传播，这种病毒主要是通过蓟马以永续型方 式传播。传播CaCV的蓟马种类尚未澄清。
[0004] CaCV属于番前斑萎病毒属（Tospovirus)的第五血清群，或WSMoV血清组。病毒 粒子为球状，直径80~110nm，粒体外层由一层脂质包裹。病毒基因组属于负单链RNA，由 L RNA、M RNA、和S RNA三个片段RNA组成。L RNA为大小约8. 92kb的负链、含单个开放 阅读框架（0RF)，编码依赖 RNA 的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase)。M RNA 和S RNA均为双义RNA，有2个0RF，反向相连。M RNA大小约4. 82kb，编码非结构蛋白 NSm (Nonstructural Protein NSm)和糖蛋白前体（Glycoprotein Precursor)。S RNA 大小约3.48kb，编码非结构蛋白NSs (Non-structural Protein NSs)和核衣壳蛋白N (Nucleocapsid Protein)〇
[0005] 国内目前对CaCV的检测主要以血清学方法和分子生物检测法为主。血 清学方法包括免疫电镜法（Immuno-specific Electron Microscopy, ISEM)、免疫 扩散法（SDS-immunodiffusion Test)、酶联免疫吸附试验（ELISA)、免疫斑点试验 (Immunoblotting Test)、胶体金标记层析技术（Gold Immunochromatography Assay， GICA)等；分子生物检测法包括斑点杂交法（Dot Hybridization)、印痕杂交法（Southern Blot或Northern Blot)、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR)等。上述方法中，基于对检测灵 敏度和快速简单的要求，以RT-PCR最为适用并且在实际工作中应用最广。RT-PCR法具有极 高的检测灵敏度，非常适合于样本的快速检测要求。目前常用于对名贵花丼品种的检查。
【发明内容】
[0006] 发明目的：本发明的目的就是提供一种适用性广、特异性好、扩增效率高的引物和 探针序列，以便对CaCV进行简易快速的田间检测或实验室检测。
[0007] 本发明的原理如下：本发明以CaCV非结构蛋白（Nonstructural Protein)基因的 Ph segment S序列（GenBank: KC953852.1)为靶序列，通过序列比对找出具有高度相似度 的片段区间，通过序列分析排除二级结构和非特异性序列区间，最终筛选出的扩增片段位 于靶序列第3041~3277碱基，产物大小为237bp。
[0008] 本发明所涉及引物以及寡核苷酸探针的序列如下（自左至右按5'端到3'端方向 排列）： 上游引物：GGT GCA AGG CCT TTA ATG CTG GA 下游引物：GAG GAT TGG ACT TTT AAG AGA A 寡核苷酸探针：A TGT GCT CTC AGG ATG A 上述寡核苷酸探针的5'端可以增加一个5~25mer的poly(dT)结构，以便更高效地 将该寡核苷酸探针的5'端固定在载体表面并提高探针的杂交效率。
[0009] 本发明所涉及的引物可根据需要在引物的5'端标记上生物素（Biotin)、碱性磷 酸酶或辣根过氧化物酶等标记物并通过杂交技术进行检测。
[0010] 用本发明引物对CaCV进行检测时，病毒RNA样品制备方法可见有关文献。检测 CaCVRT-PCR扩增产物的方法包括：（1)用琼脂糖凝胶电泳法分析扩增产物；（2)用与互补寡 核苷酸探针杂交来进行检测，包括DNA微阵列、斑点印迹法和反向斑点印迹法。上述所用的 具体实验方法均不属于本发明申请内容。
【具体实施方式】
[0011] 具体实施例一 病毒RNA逆转录反应（10 μ L的反应体系可用于逆转录1.0 ng~2.5 yg总RNA): (1)将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中：上下游引物各I pmole，带CaCV样品总RNA 1 μ g，IOmM dNTP 混合物（dATP，dGTP，dCTP 和 dTTP 均为 10mM，pH 7. 0) 0· 5 μ 1，加入灭菌 蒸馏水至6 μ L ; (2)混合物在65°C加热5分钟后，迅速置于冰上冷却，短暂离心后，加入以 下组分：5X第一链合成缓冲液2yL，0.1 M DTT I yL，40单位/yL RNasin 0· 5yL，在离 心管中轻轻将各种成分充分混合，并在37°C下孵育2分钟；（3)在室温下加入0.5 yL (200 单位/ μ L)逆转录酶，轻轻地吹打混匀，在37°C孵育50分钟。
[0012] 具体实施例二 病毒RNA逆转产物的PCR扩增： (1) 在0.211^?0?反应管中加入下列成分至终体积5(^1^1(^1^〇0嫩，5以1^10\?0? 缓冲液，1.5yL 50mM MgC12，lyL IOmM dNTP混合物，上游引物（10μΜ)和下游引物 (10 μ Μ)各1 μ L，Taq DNA聚合酶（5U/ μ L) 0· 5 μ 1，加灭菌蒸馏水至总体积50 μ L ; (2) PCR反应条件： 94°C, 2min 94°C，25s 60°C，25sj30 个循环 72 °C, 40s 72〇C,5min〇
[0013] 具体实施例三 寡核苷酸探针在杂交膜上的固定：（1)将5'端带poly(dT) 15结构的寡核苷酸探针溶 于二甲基亚砜，探针终浓度为10~20 μΜ ; (2)把探针溶液点在杂交膜正表面；（3)把点有 探针的杂交膜放入紫外交联设备中照射3~5min进行探针固定；（4)把杂交膜浸入蒸馏水 洗涤，然后放入50°C烘箱干燥IOmin备用。
[0014] 具体实施例四 杂交显色反应：（1)操作前先将杂交缓冲液（20mM Tris-HCl，50mM KC1，pH8. 4)预热到 室温，将杂交仪预热到42°C; (2)用PCR仪将PCR反应产物加热至99°C、7min然后快速冷却 至4°C、3min，使DNA解链，然后置于冰上暂时存放；（3)取10 μ L经过解链处理的PCR反应 产物与100 μ L经过预热的杂交缓冲液充分混合，将混合液加到固定了探针的杂交膜表面， 用杂交盒密封后置于杂交仪于45°C杂交2hr，用去离子水充分洗涤；（4)将杂交膜浸入含1% BSA的磷酸缓冲液（pH 8. 0)，于37°C反应30分钟，用去离子水充分洗涤；（5)加入100 μ L链 霉亲和素-碱性磷酸酶复合物(终浓度=1 μ g/mL)，于37°C反应30分钟，使链霉亲和素-碱 性磷酸酶复合物与结合在PCR产物5'端上的生物素相结合，用去离子水充分洗涤；（6)取 100XNBT 100 μ L加入到IOmL AP反应缓冲夜中，混匀后，再加入100XBCIP 100 μ 1，混匀， 即配成反应工作液，加入混合NBT/BCIP的显色反应液显色(一般约20~30min)，完成显色 后用去离子水洗绦后甩干。
【主权项】
1?本发明涉及针对辣椒萎黄病病毒（Capsicum Chlorosis Virus，CaCV)的检验检疫 和分子生物学研宄或检测方法，该方法通过逆转录PCR扩增以及DNA杂交技术检测样品中 CaCV基因，其特征在于：所进行的研宄或检测方法涉及以下引物序列（自左至右按5'端到 3'端方向排列）： 上游引物序列：GGTGCAAGGCCTTTAATGCTGGA; 下游引物序列：GAG GAT TGG ACT ITT AAG AGA A。
2. 根据权利要求1所述的研宄或检测方法，其特征在于：该研宄或检测方法涉及以下 寡核苷酸探针序列（自左至右按5'端到3'端方向排列）： 寡核苷酸探针序列：ATGTGCTCTCAGGATGA。
3. 根据权利要求1、2所述的研宄或检测方法，其特征在于：该研宄或检测方法所涉及 的寡核苷酸探针序列的5'端有一个5~25mer的poly (dT)结构。
【专利摘要】本发明属于一种基于DNA体外扩增技术的植物病毒分子生物学研究和检测方法，涉及针对辣椒萎黄病病毒（Capsicum Chlorosis Virus，CaCV）的检验检疫和分子生物学研究。本发明以CaCV非结构蛋白（Nonstructural Protein）基因的Ph segment S序列为靶序列，通过序列分析排除二级结构和非特异性序列区间，最终筛选出所需要的引物和探针。本发明的目的就是提供一种适用性广、特异性好、扩增效率高的引物和探针序列，以便对CaCV进行简易快速的田间检测或实验室检测。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-70, C12R1-94
【公开号】CN104862427
【申请号】CN201510365563
【发明人】王利兵, 彭梓, 吴志鹏
【申请人】王利兵, 吴志鹏
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月29日