用于蛋白质化学修饰的pictet-spengler连接反应的制作方法
【专利说明】用于蛋白质化学修饰的PICTET-SPENGLER连接反应
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 根据35U.S.C. § 119(e)，本申请要求2012年11月16日提交的美国临时专利申请 61/727, 501的优先权，通过引用将所述申请的全部内容并入本文。
[0003] 关于联邦政府在所赞助的研宄或开发获得的发明中的权利的声明
[0004] 本发明是在美国政府的支持下作出的，由国家卫生研宄所资助，授权编号 GM59907。美国政府在本发明中具有某些权利。
[0005] 发明背景 [0006] 引言
[0007] 用于蛋白质修饰的反应方法学在数十年来一直是一个活跃的研宄领 域。早期的策略集中在原始氨基酸的全面修饰，提供了获得各种经修饰的产物的途 径(Glazer AN(1970), "Specific Chemical Modification of Proteins"，Annu. Rev. Biochem. 39 (I) : 101-130)。然而，各种应用要求蛋白质的位点特异性修饰：生 物物理学研宄需要知道连接报道分子的位点（Michalet X、Weiss S、& J^ger M(2006), "Single-Molecule Fluorescence Studies of Protein Folding and Conformational Dynamics"，Chem. Rev. 106 (5) : 1785-1813)，制备蛋白质微阵列和功能 材料需要在特定取向上的固定（Wong LS、Khan F、&Micklefield J(2009), "Selective Covalent Protein ImmobiIization :Strategies and App Iicat ions"，Chem. Rev. 109 (9) : 4025-4053)，以及蛋白质药物与聚（乙二醇）或细胞毒素分子的缀合，其 中化学修饰的位点影响所得到的生物制品的药代动力学和治疗学性能（Shen B-Q.等 人（2012)， "Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates"，Nat. Biotechnol.30(2):184-189 ;Cho H 等人(2011), "Optimized clinical performance of growth hormone with an expanded genetic code"，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (22):9060-9065)。因此，该 领域近年来开发了用以实现蛋白质的位点特异性修饰的方法，通常涉及引入表现出生 物正交反应性的非原始官能团（Sletten EM&Bertozzi CR(2009)，"Bioorthogonal Chemistry:Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality"，Angew. Chem. Int. Ed. 48(38):6974-6998 ;Stephanopoulos N&Francis MB(2011), "Choosing an effective protein bioconjugation strategy"，Nat. Chem. Biol.7 (12):876-884)〇
[0008] 醛类和酮类是用于位点特异性蛋白质修饰化学操作的流行选择。它们作为温和 的亲电子试剂的独特反应性使得能够进行与α-效应亲核试剂如取代的肼和烷氧基胺的 选择性缀合，分别生成腙和月亏-连接的产物（Jencks WP (1964), "Simple Carbonyl Group Reactions"，Prog. Phys. Org. Chem. 2:63-128)。已经开发了多种化学方法、酶促方法和遗 传学方法将醛和酮类以位点特异性的方式引入蛋白质。这些方法包括N末端丝氨酸或苏氨 酸残基的高碘酸盐氧化（Geoghegan KF&Stroh JG(1992), "Site-Directed Conjugation of Nonpeptide Groups to Peptides and Proteins Via Periodate-Oxidation of a 2-Amino Alcohol-Application to Modification at N-Terminal Serine", Bioconjugate Chem. 3 (2) : 138-146);用以得到α -酮酰胺或乙二醛肟酰胺的磷酸吡哆醛-介导 的 N 末端转氨基作用（Gilmore JM、Scheck RA、Esser-Kahn AP、Joshi NS、&Francis MB (2006)，"N-Terminal Protein Modification through a Biomimetic Transamination Reaction"，Angew.Chem. Int. Ed. 45 (32) :5307-5311 ;Scheck RA、Dedeo MT、Iavarone AT、 &Francis MB(2008)，"Optimization of a Biomimetic Transamination Reaction"，J. Am.Chem.Soc.l30 (35):11762-11770;Witus LS.等人（2010)，"Identification of Highly Reactive Sequences For PLP-Mediated Bioconjugation Using a Combinatorial Peptide Library"，J. Am. Chem. Soc. 132 (47) : 16812-16817 ;Witus LS&Francis M(2009), uSite-Specific Protein Bioconjugation via a Pyridoxal 5'-Phosphate-Mediated N-Terminal Transamination Reaction''，Current Protocols in Chemical Biology，（John Wiley&Sons，Inc);为通过表达蛋白质连接生成的蛋白质C-末端 硫醋添加包含酮的小分子（Esser-Kahn AP&Francis MB(2008)，"Protein-Cross-Linked Polymeric Materials through Site-SelectiveBioconjugation^ , Angew. Chem. Int. Ed. 47(20) :3751-3754);通过琥珀终止密码子抑制进行的包含酮的非天然氨基酸的遗传 编码并入（Wang L、Zhang Z、Brock A、&Schultz PG(2003)，"Addition of the keto functional group to the genetic code of Escherichia coli ^ , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(1):56-61 ;Hutchins BM.等人（2011)，"Selective Formation of Covalent Protein Heterodimers with an Unnatural Amino Acid''，Chem. Biol. 18(3) :299-303 ;Kim CH 等人（2012)，"Synthesis of Bispecific Antibodies using Genetically Encoded Unnatural Amino Acids"，J. Am. Chem. Soc. 134(24):9918-9921);指导带有酸或酮的小分 子的酶促连接反应的肽标签的遗传编码（Rashidian M、Song JM、Pricer RE、&Distefano MD(2012)，"Chemoenzymatic Reversible Immobilization and Labeling of Proteins without Prior Purification^, J. Am. Chem. Soc. 134(20) :8455-8467 ；Chen KHowarth Lin W、&Ting AY(2005)，"Site-specific labeling of cell surface proteins with biophysical probes using biotin ligase"，Nat. Methods 2(2):99-104);以及用于通 过甲酰甘氨酸生成酶（FGE)进行修饰的位点的遗传编码，在我们的实验室开发的"醛标 签"方法（Carrico IS、Carlson BL、&Bertozzi CR(2007)，"Introducing genetically encoded aldehydes into proteins"，Nat. Chem. Biol. 3 (6) :321-322 ;Wu P.等人 (2009)， uSite_specific chemical modification of recombinant proteins produced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag''，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 106:3000-3005;Hudak JE、Yu HH、&Bertozzi CR(2011)，"Protein Glycoengineering Enabled by the Versatile Synthesis of Aminooxy Glycans and the Genetically Encoded Aldehyde Tag"，J. Am. Chem. Soc. 133(40):16127-16135) ;Hudak JE 等人（2012)，"Synthesis of Heterobifunctional Protein Fusions Using Copper-Free Click Chemistry and the Aldehyde Tag"，Angew. Chem. Int. Ed 51 (17) :4161-4165 ;Shi X.等人（2012)，"Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged proteins for singlemolecule imaging"，Nat. Methods 9 (5):499-503 ;Rabuka D、Rush JS、deHart GW、Wu P、&Bertozzi CR(2012)，"Site-specific chemical protein conjugation using genetically encoded aldehyde tags"，Nat. Protoc. 7(6):1052-1067) 〇
[0009] 用于将反应性羰基引入到蛋白质中的方法的多样性与已经广泛用于它们的化学 修饰的反应的有限数目形成鲜明对比。大多数的报道使用了上述的形成腙和肟的反应， 是因为它们的生物正交性、操作的简单性（即，不需要辅助试剂）、以及在温和的含水条件 下的良好收率。然而，得到的C = N键容易受到水解的影响（Mueller BM、Wrasidlo WA、 &Reisfeld RA(1990), "Antibody conjugates with morpholinodoxorubicin and acid cleavable linkers"，Bioconjugate Chem. I (5): 325-330)，影响了 它们在需要长时间稳 定性的情况中的应用。例如，认为在Mylotarg (a -CD33与细胞毒素卡奇霉素的一种抗 体-药物缀合物）中腙的不稳定性是导致了使所述药物退出美国市场的致命原因之一 (Ducry L&Stump B(2009), "Antibody-Drug Conjugates:Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies"，Bioconjugate Chem. 21 (I) :5_13)。月亏被称为对于水解 最稳定的C = N连接，但是它对于在稀释条件下的水解仍是热力学不稳定的，通过酸催 化过程而分解（Kalia J&Raines RT(2008)，"Hydrolytic Stability of Hydrazones and Oximes"，Angew. Chem. Int. Ed. 47(39) :7523-7526)。许多研宄人员发现，在理想存 储条件（低温、高浓度、和中性或高pH)下的肟缀合物是动力学稳定的，并由此适合于短 期的实验室研宄（Hudak JE、Yu HH、&Bertozzi CR(2011), "Protein Glycoengineering Enabled by the Versatile Synthesis of Aminooxy Glycans and the Genetically Encoded Aldehyde Tag"，J.Am.Chem.Soc. 133 (40):16127-16135) ;Shi X.等人 (2012), "Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged prot