具有增加比例的e1b蛋白质的156r剪接同工型的溶瘤腺病毒的制作方法

文档序号:8547615阅读:677来源:国知局
具有增加比例的e1b蛋白质的156r剪接同工型的溶瘤腺病毒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及溶瘤腺病毒及其在治疗肿瘤性疾病中的用途。更特别地,本发明涉及 E1B基因的突变,所述突变调节该基因的剪接同工型的水平,从而改善溶瘤腺病毒的治疗指 数。
[0002] 发明背景
[0003] 溶瘤病毒
[0004] 溶瘤病毒疗法为用于癌症治疗的新兴的治疗平台。溶瘤病毒为在具有特异性致癌 表型的癌细胞中选择性复制,从而杀死癌细胞同时避免杀死正常细胞的病毒。初步研宄集 中于天然存在的非致病性病毒,然而,这些研宄成果有限。虽然观察到肿瘤生长减缓并且正 常组织未受损,但病程未发生改变。
[0005] 因此,最近的研宄已经集中于选择性地靶向癌细胞的工程重组病毒。该类工程病 毒的一个实例为在病毒基因组的E1B区突变的腺病毒。
[0006]腺病毒的E1B和d53
[0007] 哺乳动物肿瘤抑制蛋白p53的一种功能为介导响应于DNA损伤或外源DNA合成的 细胞周期停滞和/或细胞凋亡。因此,一些病毒,诸如腺病毒,编码在受感染细胞中使P53 失活的蛋白质以允许高效的病毒复制。这些蛋白质中的一种蛋白质,来自腺病毒的E1B区 的55千道尔顿蛋白质(E1B-55K或E1B-496R),结合于p53,因此引起p53的大量丧失。这 从而防止P53-介导的受感染细胞的细胞凋亡。因此,E1B-496R对于在含有功能性p53的 细胞中的腺病毒的复制而言是必需的。
[0008] 人肿瘤细胞对于突变的(如置换、删除、移码突变)p53等位基因经常为纯合或 杂合的,并缺乏对于正常控制细胞周期必需的p53功能(Hollstein等人(1991)Science 253:49;Levine等人(1991)Nature;351 (6326) :453-6)。因此,许多瘤细胞为p53H,因为 它们缺乏足够水平的P53和/或因为它们表达突变形式的p53,所述突变形式不能够发挥基 本的P53功能。
[0009]E1B突变的腺病毒
[0010] 利用瘤细胞与正常细胞之间的P53功能性差异已经对溶瘤腺病毒进行工程改造。 通过使E1B-496R蛋白质突变以除去与p53的结合相互作用或通过在E1B基因座内做出各 种删除(参见,例如US5, 677, 178),所得腺病毒可复制并最终裂解基本上缺乏p53功能的癌 细胞,但在具有正常P53功能的细胞中并不发生裂解。
[0011] 一个实例为0NYX-015 (最初命名为dl1520并且也称为H101),一种不表达 E1B-496R蛋白质的突变腺病毒(Heise等人(1997)Nat.Med. 3(6):639-645)。病毒在翻译 起始密码子之后立即含有终止密码子并且也具有大量缺失的E1B-496R编码序列。结果该 病毒缺乏结合P53并使p53失活的能力,因此仅可在p53功能缺陷的细胞(诸如瘤细胞和 肿瘤)中高效地复制。不幸的是,E1B-496R发挥除了结合p53并使p53失活以外的其它功 能(Eager等人(2001)CancerGeneTher. 18 (5): 305-317)。因此,0NYX-015 病毒在病毒晚 期mRNA的细胞质积聚、宿主细胞关闭以及晚期mRNA的翻译中存在缺陷。因此,ONYX-015中 的突变降低突变病毒在肿瘤细胞中自身繁殖的能力。另外的问题为大量缺失使病毒基因组 不稳定。
[0012] 另外的实例为0NYX-051和0NYX-053,它们为在E1B-496R蛋白质中含有点突变 (分别为R240A和H260A)而防止结合于p53的突变腺病毒。这些突变使病毒能够在p53功能 有缺陷的细胞中选择性复制,而不会降低病毒在这些细胞中复制的能力(Shen等人(2001) J.Virol. 75 (9) : 4297-4307 和US7, 785, 887)。
[0013] 然而,仍迫切需要改进的突变病毒,其溶瘤能力已经得到增强并且可用于癌症的 治疗。
[0014] 发明的公开内容
[0015] 本发明人已经发现通过调节E1B基因表达的E1B基因产物的剪接同工型的水平和 类型,此类病毒的溶瘤活性可得到增强。因此,本发明的第一方面提供了重组腺病毒,在所 述重组腺病毒中E1B-156R同工型的比例相对于野生型水平有所增加,其中腺病毒在癌细 胞中具有溶瘤作用。重组腺病毒可以携带突变,如此E1B-156R同工型的比例相对于野生型 水平有所增加,使得腺病毒在癌细胞中具有溶瘤作用。突变可以在腺病毒的E1B基因的序 列中。因此,根据本发明的病毒在非瘤细胞中为复制受抑制的,但能够在瘤细胞(包括基本 上缺乏功能性P53的瘤细胞)中表达复制表型。
[0016] 在本文描述的腺病毒的特异性实例中,E1B-156R的过表达被认为是由在腺病毒的 E1B基因中突变的93R剪接位点引起的失衡。156R能够补足某些496R功能,但并非对肿瘤 选择性(oncoselectivity)必需的功能。与现有技术相似类型的病毒相比,根据本发明的 病毒包括较好的体内功效的功能性E3B区。例如,Onyx-015缺乏E3B。事实上,Onyx-015病毒 及其选择性在所有方面远不如根据本发明的病毒。此外,发明人已经在正常细胞中测试根 据本发明制备的病毒,结果显示病毒具有显著的安全概况,特别是与已知的病毒Onyx-015 相比较。
[0017] 本文中,术语"复制受抑制的病毒"或"复制缺陷的"是指在转化成癌症状态或瘤状 态的预定的细胞群中优先地抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的病毒。此类病毒在特征为非复 制的、非转化的细胞的包含正常的P53功能水平的细胞中基本上不能抑制细胞增殖、诱导 细胞凋亡或表达复制表型。此类转化细胞可以基本上缺乏P53功能,所述缺乏支持病毒复 制表型的表达。然而,根据本发明的病毒对瘤组织的选择性可能比仅为P53状态更广泛;像 这样的转化状态可能为选择的基础。例如,已经表明用0NYX-015病毒观察到的溶瘤选择性 可能是由于一些癌细胞系支持晚期病毒RNA从细胞核输出的能力(在正常细胞中0NYX-015 由于E1B-496R缺失而丧失的功能)。相似的机制可以在本发明的重组腺病毒中操作,所述 重组腺病毒具有降低水平的E1B-496R蛋白质。本发明的重组腺病毒中E1B-156R水平的增 加如何导致溶瘤选择性还未完全清楚。
[0018] 通常,根据本发明的复制受抑制的病毒在包含正常的p53功能的细胞上的噬斑 效率显示出显著减少(针对合适的测定,参见Wang,Y.,G.Hallden等人(2003).〃E3gene manipulationsaffectoncolyticadenovirusactivityinimmunocompetenttumor models."Naturebiotechnology21 (11): 1328-1335) ^ 可以使用的合适测定的另一实例为 使用例如四唑鑰染料诸如MTT、XTT、MTS或WST进行细胞毒性测定以测量活细胞的丧失(参 见Berridge等人,Biotechnology Annual Review, 11:127-152 (2005)。
[0019] 如本文所用,术语"复制表型"是指被病毒诸如复制受抑制的腺病毒感染的细胞的 以下表型特征中的一种或多种:(1)晚期基因产物,诸如衣壳蛋白(如,腺病毒的五邻体基 质多肽)或由病毒晚期基因启动子起始的RNA转录物的显著表达;(2)病毒基因组的复制 或复制中间体的形成;(3)病毒衣壳或包装的病毒体颗粒的装配;(4)在受感染细胞中细胞 病变效应(CPE)的出现;(5)病毒裂解周期的完成;以及(6)其它表型改变,在感染有编码 功能性癌蛋白的野生型复制-感受态DNA病毒的非瘤细胞中p53功能丧失后,所述表型改 变通常为偶然的。根据本发明的复制表型包括至少一种上文列出的表型特征,优选多于一 种表型特征,诸如2、3、4、5、6或更多种特征。
[0020] 测量这些表型的技术对本领域技术人员将为已知的。例如,评价CPE出现的方法 在本文的实施例中进行了描述并使用50%的组织培养感染剂量(TCIDJ以及噬斑形成单 位(pfu) /细胞的数目(在感染日的细胞计数)进行评估。
[0021] 术语"瘤细胞"是指显示出相对自发性生长,使得它们显示出特征为细胞增殖显著 失控的异常生长表型的细胞。瘤细胞包括可以活性复制或处于暂时非复制休止态(G1或 G0)的细胞;相似地,瘤细胞可以包括具有分化良好表型的细胞、低分化表型的细胞或两种 类型的细胞的混合物。因此,并非所有瘤细胞在给定的时间点处必定复制细胞。于此定义 为瘤细胞的细胞组由在良性肿瘤中的细胞以及在恶性(或浸润性(frank))肿瘤中的细胞 组成。浸润性瘤细胞经常被称为癌症,如果源于内胚层的或外胚层的组织学起源的细胞,则 通常为癌,或如果源于衍生自中胚层的细胞类型,则通常为肉瘤。术语瘤细胞和癌细胞在本 文中可互换地使用。
[0022] 于此,术语"p53功能"是指具有基本上正常水平的由p53基因编码的多肽的性 质(即,相对于相同组织学类型的非瘤细胞),其中P53多肽能够结合于野生型腺病毒 E1B-49
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