组合物及使用方法
【专利说明】
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月7日提交的国际专利申请PCT/CN2012/086179的优先权， 将该国际专利申请以引用方式全文并入本文。
技术领域
[0003] 本组合物和方法涉及源自褐色喜热裂孢菌（Thermobifidafusca)的|3 -甘露聚 糖酶、编码甘露聚糖酶的多核苷酸以及它们的生产和使用方法。含有重组甘露聚 糖酶的制剂具有广泛的用途，例如用于水解某些软木类型的木质纤维素材料和/或包含半 乳葡甘露聚糖（GGM)和/或葡甘露聚糖（GM)的木质纤维素生物质底物。
【背景技术】
[0004] 纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们可被多种产生 能够将聚合物底物水解成单体糖类的胞外酶的微生物（例如，细菌、酵母和真菌）降解和 用作能源（Aro等人，（2001)，J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》），276:24309-24314)。因为 非可再生资源方法的局限性，纤维素成为主要可再生能源的潜能是巨大的（Krishna等人， (2001)，BioresourceTech.(《生物资源技术》），77:193-196)。通过生物过程有效利用 纤维素是克服食品、饲料和燃料短缺的一种途径（Ohmiya等人，（1997)，Biotechnol.Gen. EngineerRev.(《生物技术和遗传工程评论》），14:365-414)。
[0005] 木质纤维素生物质材料的酶促水解大多集中于纤维素酶，其为水解纤维素（包含 0-1，4-葡聚糖或0D-葡糖苷键）而导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的酶。传统上 将纤维素酶分为三大类：内切葡聚糖酶（EC3. 2. 1. 4) ( "EG")、外切葡聚糖酶或纤维二糖水 解酶（EC3. 2. 1. 91) ("CBH"）和0 -葡糖苷酶（[f3 ]-D-葡糖苷葡糖水解酶；EC3. 2. 1. 21) ("BG"）（Knowles等人，（1987)，TIBTECH，5:255-261 ;以及Schulein，（1988)，Methods Enzymol.(《酶学方法》），160:234-243)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的非晶部分， 而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素（Nevalainen和Penttila，1995年，Mycota(《菌 界》)，303-319)。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存在是结晶纤维素有效溶解所 必需的（Suurnakki等人，（2000)，Cellulose(《纤维素》），7:189-209)。0-葡糖苷酶起到 从纤维二糖、纤维低聚糖和其他葡糖苷释放D-葡萄糖单元的作用（Freer，（1993)，J.Biol. Chem.(《生物化学杂志》），268:9337-9342)。
[0006] 但是，为了从木质纤维素生物质材料获得有用的可发酵糖，木质素通常将首先需 要例如通过各种预处理方法进行透化，并且使半纤维素破坏以便纤维素酶接触到纤维素。 半纤维素具有复杂的化学结构，它们的主链由甘露聚糖、木聚糖和半乳聚糖组成。甘露聚糖 类型的多糖存在于多种植物和植物组织中，例如存在于植物的种子、根、鳞茎和块茎中。这 类糖可包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖，并且它们通常含有直链0 -1，4-连接 的甘露糖单元和/或半乳糖单元构成的直链和散布链（interspersedchain)。大多数类型 的甘露聚糖不溶于水中，从而形成某些植物组织（如棕榈仁和象牙椰子）的硬度特性。另 一方面，半乳甘露聚糖往往可溶于水中，并且存在于豆科植物的种子胚乳中且据信有助于 保持这些种子中的水。
[0007] 复杂的木质纤维素结构和相当顽拗的植物细胞壁的酶促水解涉及许多不同的内 切酶和外切酶（例如纤维素酶和半纤维素酶）的协同和/或相续的作用。木聚糖酶和 0-甘露聚糖酶是内切酶，而甘露糖苷酶、葡糖苷酶和a-半乳糖苷酶是外切酶。 为破坏半纤维素，可将木聚糖酶与其他辅助蛋白（其非限制性例子包括L-a_阿拉伯呋喃 糖苷酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡萄糖醛酸酶和木糖苷酶）一起应用。
[0008] 内切-1,4-0-D-甘露聚糖酶（E.C. 3. 2. 1.78)催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘 露聚糖和半乳葡甘露聚糖的主链中的0-1，4-甘露糖苷键的随机水解，释放出短链和长链 寡甘露糖苷。短链寡甘露糖苷可包括甘露二糖和甘露三糖，不过有时候也可包括一些甘露 糖。这些短链寡甘露糖苷可被0 _甘露糖苷酶（E.C. 3. 2. 1. 25)进一步水解。另外，杂多糖 的侧链糖可例如通过a-半乳糖苷酶、葡糖苷酶和/或通过乙酰甘露聚糖酯酶进一步 水解至完全。PulsJ.，（1997)，Macromol.Symp.(《大分子评论集》）120:183-196。
[0009] 已从细菌、真菌、植物和动物分离了 甘露聚糖酶。参见AraujoA.等人， (1990)，J.App.Bacteriol.(《应用细菌学杂志》）68:253-261;DuttaS.等人，（1997)，PlantPhysiol.(《植物生理学》）113:155-161;PucharV.等人，（2004)Biochim.Biophys. Acta(《生物化学与生物物理学学报》）1674:239-250。还已克隆了来自多种生物体的编码 这些酶的基因并进行了测序，基于它们的序列，它们中许多（如果不是全部的话）也已被归 类为糖基水解酶（GH)家族5或者26的成员。参见例如BewleyD.J.，（1997)，Planta(《植 物》)203:454-459;HalsteadJ.R.等人，（2000)，FEMSMicrol.Lett.(《欧洲微生物学会联 合会微生物学快报》）192:197-203;XuB.等人，（2002)，Eur.J.Biochem.(《欧洲生物化学杂 志》）269:1753-1760 ;Henrissat，B.，（1991)，Biochem.J.(《生物化学杂志》）280:309-316〇 尽管大多数甘露聚糖酶由其来源生物分泌，但有一些已知与细胞结合。从一给定的生 物体，可能有不止一种源自不同的基因或者相同基因的不同产物、具有不同的等电点的甘 露聚糖酶，这个事实据信是这些酶的重要性的指示。
[0010] e-甘露聚糖酶已在商业应用中使用，例如在诸如纸张和纸浆行业、食品和饲料行 业、医药行业和能源行业之类的行业中使用。LeeJ.T.等人，（2003)，Poult.Sci.(《禽类 科学》），82:1925-1931;McCutchenM.C.等人，（1996)，Biotechnol.Bioeng.(《生物技术与 生物工程》）52:332_339;311111'仙1^1八.等人，（1997)，八(1￥.13;[0(3116111.￡叩.13;[0七6(3111101.(《生 物化学工程与生物技术进展》)57:261-287。但是，取决于甘露聚糖酶的来源微生物，不同的 0 -甘露聚糖酶可具有不同的性质和活性谱（activityprofile)，这些不同的性质和活性 谱可能使它们更适合于一种或多种工业应用而不适合于其他工业应用。木质纤维素生物质 底物（尤其是来自植物来源的那些木质纤维素生物质底物）的水解众所周知是困难的，因 此，已被发现可用于其他工业应用的甘露聚糖酶中很少（如果有的话）已被用来水解木质 纤维素材料。
[0011] 因此，对于鉴定这样的甘露聚糖酶和/或包含这种酶的组合物存在着需求，所述 甘露聚糖酶和/或组合物与市售的、新鉴定的或者工程改造的纤维素酶和其他半纤维素酶 联合，可有效地并能够将多种基于植物的和/或其他的纤维素或者半纤维素材料转化成可 发酵糖，同时具有足够的或者改善的效力、改善的可发酵糖产率和/或改善的作用于多种 多样的纤维素原料的能力。使用工程改造的微生物产生新的甘露聚糖酶也是重要的和合乎 期望的，因为这些是可能高成本效益地制备酶的手段。
【发明内容】
[0012] 本组合物和方法的一个方面是应用或者使用从褐色喜热裂孢菌（Thermobifida fusca)菌株YX这个细菌物种分离的高活性甘露聚糖酶（TfuManl)来水解木质纤维素 生物质底物。本文描述的SEQIDN0:2的序列由LykidisA.等人作为褐色喜热裂孢菌的 基因组序列的一部分提交和公布至J.Bacteriol.(《细菌学杂志》）（2007) 189(6) : 2477-86 ; 以及由Copeland等人、由DOEJointGenomeInstitute提交和公布至NCBI，为其指定登录 号YP_288961。该序列由NCBI命名为内切-1，4-0 -甘露糖苷酶，但迄今尚未被重组表达、 以工业或商业上相关的量表达或应用于工业应用。TfuManl多肽尚未由经工程改造的微生 物表达。它们也尚未与一种或多种纤维素酶基因和/或一种或多种半纤维素酶一起共表达 或与一种或多种纤维素酶基因和/或一种或多种半纤维素酶一起包括在组合物中。
[0013] 因此本发明的一个方面是这样的发现，即与SEQIDN0:2或者与成熟序列SEQID NO: 3 (其为SEQIDNO: 2的残基29-453)具有至少65% (例如至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少91%、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95 %、至少96%、至少97 %、至少98 %、至少99 %或更高）同一性的多肽具有 甘露聚糖酶活性。本发明的另一个方面是这样的发现，即当这样一种多肽与一种或多 种纤维素酶和/或一种或多种其他半纤维素酶组合时可赋予该组合物或混合物改善的水 解木质纤维素生物质底物的能力。这种改善包括例如选自以下的性质中的一者或多者：葡 聚糖转化提高、从给定的生物质底物得到葡萄糖的产率提高、木聚糖转化提高、木糖产率提 高、从给定的生物质底物得到总可溶性糖的产率提高、在某一固形物水平下的给定生物质 底物的液化更加快速以及在某一固形物水平下的生物质底物的粘度降低更加快速。改善还 可包括这样的出乎意料的发现，即这种多肽当与任选还包含一种或多种其他半纤维素酶的 纤维素酶混合物或者组合物进行组合时，可用于增强纤维素生物质的转化和水解。所得的 包含TfuManl多肽的混合物与具有相同浓度/比例/量的所有其他酶但不具有TfuManl 的对等混合物相比，具有改善的水解性能。在一些实施例中，TfuManl多肽可替代例如高 达约20重量％ (例如高达约20重量％、高达约18重量％、高达约16重量％、高达约14重 量％、高达约12重量％、高达约10重量％、高达约8重量％、高达约5重量％等）的纤维素 酶混合物或者组合物，并且该替代的组合物当用于水解给定的木质纤维素生物质底物时将 保留其能力和水解性能，或者甚至与未被取代的但具有相同酶组成和相同总蛋白的对等纤 维素混合物或者组合物相比具有改善的水解（例如较高的葡聚糖和/或木聚糖转化率、较 高的总糖产量、较快的液化和/或改善的粘度降低）。
[0014] 本组合物和方法的一个方面涉及源自褐色喜热裂孢菌的糖基水解酶家族5的 0-甘露聚糖酶多肽（在本文中称为"TfuManl"或者"TfuManl多肽"）、编码所述酶多肽 的核酸、包含所述酶多肽的组合物以及制备所述0_甘露聚糖酶多肽及包含其的组合物并 将它们应用于水解或者转化木质纤维素生物质为可溶性可发酵糖的方法。特别合适的木质 纤维素生物质材料是那些含有半乳葡甘露聚糖（GGM)和/或葡甘露聚糖（GM)的木质纤维 素生物质材料然后可将此类可发酵糖转化成纤维素乙醇、燃料以及其他生物化学物质和可 用产物。在某些实施例中，甘露聚糖酶多肽当与包含至少一种纤维素酶或至少一种其他 半纤维素酶的酶混合物或者与包含至少一种纤维素酶和至少一种其他半纤维素酶的酶混 合物进行组合时，所得到的酶混合物与例如来自各种微生物的、具有类似的最佳pH和/或 类似的最佳温度的其他0 _甘露聚糖酶相比，能够具有提高的或者增强的水解木质纤维素 生物质材料的能力。
[0015] 这种提高的或者增强的水解木质纤维素生物质材料的能力例如反映在以下方面： 不仅由经某种方式预处理的给定木质纤维素生物质底物的酶促水解所产生的总可溶性糖 的产量极大地提高，而且出乎意料的是葡萄糖的产量也提高（反映较高的葡聚糖转化率） 和/或木聚糖的产量也提高（反映较高的木聚糖转化率）。
[0016] 该提高的或者增强的水解木质纤维素生物质材料的能力，也可反映在这种酶组合 物改善或者加速经预处理的生物质材料的液化和/或降低其粘度的合乎期望的能力。如果 使用高固形物水平的生物质材料作为底物的话，这种粘度/液化有益效果是最显著的。当 使用该酶组合物/混合物来分解或者水解往往具有高度纤维性和顽拗性（recalcitrant) (这种性质导致特别粘稠的原料）的木材生物质时，这种粘度/液化有益效果也是巨大和重 要的。<