卵子供体妊娠中胎儿非整倍性的无创检测的制作方法

卵子供体妊娠中胎儿非整倍性的无创检测的制作方法
【专利说明】卵子供体妊娠中胎儿非整倍性的无创检测
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年12月19日提交的美国专利申请号13/720, 273的权益，美 国专利申请号13/720, 273为于2011年12月28日提交的美国专利申请号13/338, 963的 继续部分申请，美国专利申请号13/338, 963为于2011年12月9日提交的美国专利申请号 13/316, 154的继续部分申请，美国专利申请号13/316, 154要求于2011年1月25日提交的 美国临时专利申请号61/436, 135的优先权，所有这些专利申请被转让给本发明的受让人 并且通过引用并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及卵子供体妊娠中的遗传异常的诊断以及用于此类诊断的测定系统。
[0004] 发明背景
[0005] 在以下讨论中，为了背景和介绍的目的将描述某些文章和方法。本文包含的任何 事物不被理解为对现有技术的"承认"。申请人明确地保留在适当的情况下表明本文引用的 文章和方法基于适用的法定条款不构成现有技术的权利。
[0006] 遗传异常导致大量的病理，包括由染色体非整倍性引起的病理（例如唐氏综合 征）、在特定基因上的生殖系突变（例如，镰状细胞性贫血）、和由体细胞突变引起的病理 (例如，癌症）。用于确定此类遗传异常的诊断方法已变成用于鉴定特定疾病和紊乱以及提 供有关疾病来源和治疗选择的有价值的信息的标准技术。
[0007]例如，产前筛选和诊断在产前保健中被常规地提供并且被认为在允许妇女做出关 于受遗传状况影响的妊娠的知情选择方面是重要的。产前诊断测试的常规方法目前要求利 用通常地在11和14周妊娠之间的绒毛膜绒毛取样（CVS)或通常地在15周之后的羊膜穿 刺术从子宫直接地取出胎儿细胞的样品用于遗传分析。但是，这些侵入性操作带有约1 %的 流产的风险。Mujezinovic和Alfirevic，ObstetGynecol2007;110:687-694。
[0008] 尽管这些获得胎儿DNA的方法目前提供了用于产前诊断的金标准测试，但是很多 妇女决定不经受侵入性测试，主要是因为其是令人不愉快的并且带有小但是显著的流产 的风险。长期以来已在寻求用于无创产前诊断的可靠且方便的方法来减少该流产风险并 允许更早的测试。尽管一些工作已利用从宫颈粘液获得的胎儿细胞研宄（FejginMD等 人，PrenatDiagn2001 ;21:619-621;Mantzaris等人，ANZJ0G2005 ;45:529-532)，但是大 多数的研宄集中于用于检测来自胎儿、存在于母体循环中的遗传元件的策略。已证实在妊 娠期间在胎儿和母体之间有双向的流通（Lo等人，Blood1996 ;88:4390-4395)，并且多个 研宄已显示，完整的胎儿细胞和无细胞的胎儿核酸两者穿过胎盘并且在母体的血流中循环 (参见例如ChiuRW和LoYM,SeminFetalNeonatalMed. 2010 年 11 月 11 日）。
[0009] 特别地，鉴定非整倍性的最近的尝试已使用母体血液作为起始材料。此类努力已 包括使用无细胞DNA以检测来自怀孕女性的样品中的胎儿非整倍性，包括利用大规模平行 鸟枪测序（MPSS)来精确地定量来自三体性染色体的cfDNA片段的增加。但是，来源于胎儿 非整倍性的染色体剂量直接地与胎儿cfDNA的比例有关。由于胎儿对母体样品的贡献的水 平将改变用于计算胎儿染色体为非整倍体的风险需要检测的量，所以在样品之间胎儿核酸 贡献的变化能因此使分析复杂化。
[0010] 例如，来自患有21三体综合征的胎儿的含4%DNA的cfDNA样品应表现出在来自 染色体21 (chr21)的读数的比例方面与正常胎儿相比2%的增加。利用具有4%的胎儿核 酸百分比的母体样品以高的可信度从正常胎儿区分21三体综合征需要大量（>93K)的染色 体21观察，其是有挑战性的并且利用诸如MPSS的非选择性技术是并非成本有效的。
[0011] 因此对在含有正常和假定的异常DNA的混合样品中筛选包括非整倍体的遗传异 常的无创方法存在需求。本发明满足该需求。
[0012] 发明概述
[0013] 提供该概述以以简化的形式介绍在以下在详细描述中进一步描述的观念的精选。 该概述并非意图标识所要求保护的主题的关键或本质特征，也并非意图用来限制所要求保 护的主题的范围。根据以下书写的包括在所附的附图中表明以及在所附的权利要求中限定 的那些方面的详细描述，所要求保护的主题的其它特征、细节、效用、和优势将是明显的。
[0014] 本发明提供了用于确定包括卵子供体妊娠中的基因组材料（例如无细胞DNA)的 母体样品中的遗传异常的测定系统和相关方法。可利用多种技术来进行用于确定胎儿非整 倍性的分析。
[0015] 确定来自卵子供体妊娠的母体样品中胎儿DNA的相对百分比提供可指示关于胎 儿非整倍性的核酸区域的相对统计存在的重要信息。确定其中胎儿具有不同于载体的等位 基因的至少一个等位基因的基因座能允许估计母体样品中的胎儿DNA，并且由此提供用来 计算感兴趣的染色体的染色体频率的统计上的显著差异的信息。因此此类基因座在测定中 能提供两种形式的信息-等位基因信息能被用于确定母体样品中的胎儿DNA贡献百分比并 且来自检测技术的等位基因信息的经验确定（例如，等位基因检测水平的总和）能被用来 确定母体样品中的该基因座的相对总体频率。但是，对于确定该基因座的相对总体频率，等 位基因信息是不被需要的。
[0016] 因此，在一些特定的方面，在感兴趣的等位基因处母体DNA的相对胎儿贡献可与 该等位基因处的非母体贡献比较以确定样品中的近似胎儿DNA浓度。在特定的方面，在其 中胎儿DNA具有不同于母体等位基因的至少一个等位基因的那些基因座处，确定了母体样 品中的胎儿DNA的估计。在卵子供体妊娠中，这可包括其中母体或胎儿基因型是纯合的并 且另一个是杂合的基因座，以及其中母体和胎儿基因型均是纯合的并且两个胎儿等位基因 不同于母体等位基因的基因座。在该情况下，可利用卵子供体提供信息的（informative) 基因座的亚组来确定胎儿DNA量。
[0017] 在一个特定的方面，本发明提供了用于确定来自具有卵子供体妊娠的妊娠女性的 母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比，所述方法包括提供含有母体和胎儿的无细胞DNA的 母体样品；询问两种或更多种选择的多态的核酸区域；检测询问的核酸区域；确定询问的 核酸区域中的多态性的相对频率以鉴定卵子供体提供信息的基因座；利用鉴定的卵子供体 提供信息的基因座来计算胎儿无细胞DNA百分比。
[0018] 在某些特定的方面，由于确定母体样品中胎儿DNA的相对百分比将提供关于胎儿 染色体的预期的统计存在的重要信息并且从该预期的偏差可表明胎儿非整倍性，所以确定 母体样品中胎儿DNA的相对百分比在执行或优化从测定系统获得的结果中是有益的。能利 用很多方法来计算在母体样品中胎儿DNA的相对贡献。
[0019] 在一个特定的方面，本发明提供了用于提供在具有卵子供体妊娠的妊娠女性中胎 儿非整倍性的存在或不存在的统计可能性的测定系统，包括提供含有母体和胎儿的无细胞 DNA的母体样品；询问来自第一染色体的两个或更多个核酸区域；定量来自第一染色体的 核酸区域的等位基因的相对频率；询问来自第二染色体的两种或更多种选择的核酸区域； 比较来自第一染色体的核酸区域的相对频率和来自第二染色体的核酸区域的相对频率；计 算母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比；以及利用计算的母体样品中的胎儿无细胞DNA百 分比提供胎儿非整倍性的存在或不存在的统计可能性。
[0020] 在一个特定的方面，本发明提供了用于提供具有卵子供体妊娠的妊娠女性中胎儿 非整倍性的存在或不存在的统计可能性的测定系统，包括提供含有母体和胎儿的无细胞 DNA的母体样品；询问来自第一染色体的两个或更多个核酸区域；检测询问的来自第一染 色体的核酸区域；定量来自来自第一染色体的核酸区域的等位基因的相对频率：询问来自 第二染色体的两个或更多个选择的核酸区域；检测询问的来自第二染色体的核酸区域；定 量来自来自第二染色体的核酸区域的等位基因的相对频率；比较来自第一染色体的核酸区 域的相对频率和来自第二染色体的核酸区域的相对频率；计算母体样品中的胎儿无细胞 DNA百分比；以及利用计算的母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比来提供胎儿非整倍性的 存在或不存在的统计可能性。
[0021] 在一个特定的方面，本发明提供了用于提供具有卵子供体妊娠的妊娠女性中胎儿 非整倍性的存在或不存在的统计可能性的测定系统，包括提供含有母体和胎儿的无细胞 DNA的母体样品；询问来自第一染色体的两个或更多个核酸区域；定量来自来自第一染色 体的核酸区域的等位基因的相对频率；询问来自第二染色体的两个或更多个选择的核酸区 域；定量来自来自第二染色体的核酸区域的等位基因的相对频率；比较来自第一染色体的 核酸区域的相对频率和来自第二染色体的核酸区域的相对频率；计算母体样品中的胎儿无 细胞DNA百分比；以及利用计算的母体样品中的胎儿无细胞DNA百分比来提供胎儿非整倍 性的存在或不存在的统计可能性。
[0022] 在一些方面，母体样品中胎儿DNA贡献百分比通过确定一个或更多个非母体贡献 的基因座的水平来计算，所述非母体贡献的基因座包括在性染色体上的基因座和常染色体 基因座。在利用常染色体基因座的方面，通常地胎儿DNA贡献百分比通过使非母体基因座 上的一个或更多个遗传变异与母体基因座比较来确定。在一些特定的方面，这些遗传变异 为拷贝数变异。在其它的特定的方面，这些遗传变异为一个或更多个单核苷酸多态性。
[0023] 该测定系统优选地针对每个感兴趣的染色体分析至少十个多态的核酸区域，更优 选地针对每个感兴趣的染色体分析至少二十个多态的核酸区域，更优选地针对每个感兴趣 的染色体分析至少四十个多态的核酸区域，并且甚至更优选地针对每个感兴趣的染色体分 析至少九十个多态的核酸区域。
[0024] 本发明的测定系统可被配置作高度多路的系统，其允许来自单个样品和/或多个 样品内的单个或多个染色体的多个核酸区域被同时地分析。在此类多路系统中，样品可被 单独地分析，或其可最初被混合入两个或更多个组用于更大量样品的分析。当获得混合数 据时，在分析非整倍性之前，优选地针对不同样品鉴定此类数据。但是，在一些方面，可针对 潜在的非整倍性分析混合数据，并且如果初始结果指示在混合的组内检测出潜在的非整倍 性，则随后地分析来自组的单个样品。
[0025] 在某些方面，测定系统利用为样品或基因座标识提供信息的一个或更多个标志 (index)。例如，在选择性扩增中使用的引物可具有对基因座特异的另外的序列，例如，指示 选择的核酸区域或该核酸区域的特定等位基因的核酸序列。在另一个实例中，在选择性或 通用扩增中使用指示核酸从其被扩增的样品的标志。在仍然另一个实例中，独特标识标志 被用来使特定的扩增产物区别于从检测方法获得的其它的扩增产物。单标志还可与任何其 它标志联合以广生为两种特性提供彳目息的一个标志（例如，样品标识标志、等位基因座标 志）。
[0026] 在某些方面，利用通用扩增方法来扩增核酸区域。例如可在初始选择性扩增或从 来自卵子供体妊娠的母体样品富集的步骤之后进行通用扩增。通用扩增的使用允许利用单 个或有限数目的扩增引物扩增多个核酸区域，并且在于单个反应中扩增多个选择的核酸区 域中是特别有用的。这允许来自单个或多个样品的多个核酸区域的同时处理。
[0027] 用来分析的母体样品可从具有卵子供体妊娠的任何妊娠妇女获得或衍生。例如， 母体样品可来自含有母体和胎儿两者的无细胞DNA的任何母体流体，包括但不局限于母体 血浆、母体血清、或母体血液。
[0028] 在优选的方面，相应于来自染色体的多个核酸区域的靶核酸被检测并且频率被用 来确定母体样品中的染色体的相对频率。相应于一个染色体的核酸区域当与相应于母体样 品中的另一个染色体的核酸区域的量相比时，频率比预期的高指示胎儿的加倍、缺失或非 整倍性。比较可以是在胎儿染色体中假定插入或缺失的感兴趣的基因组区域的比较。比较 还可以是每个可为胎儿中的假定的非整倍体的多个染色体（例如，染色体18和21)的比 较，其中两者均为非整倍体的可能性是极低的。比较还可以是其中一个为假定的非整倍体 (例如，染色体21)并且其他的作为参考染色体（例如，诸如染色体12的常染色体）的多个 染色体的比较。在仍然其它的方面，比较可利用假定为非整倍体的两个或更多个染色体和 一个或更多个参考染色体。
[0029] 这些和其它的方面、特征和优势将更详细的被提供，如本文描述的。
[0030] 附图简述
[0031] 图1是用于确定母体样品中的胎儿无细胞DNA贡献百分比的一般步骤的简化流程 图。
[0032] 图2是卵子供体妊娠中在特定的基因座处母体、卵子供体和胎儿基因型的组合的 表。
[0033] 图3是对于胎儿比例相关组和胎儿比例无关组的胎儿比例比较的图。
[0034] 图4A-4C是对于含有来自女性的75 %、80 %、85 %、90 %和95 %血浆的混合样品利 用多态的测定和性染色体测定两者比较估计的贡献百分比的柱形图。
[0035] 发明详述
[0036] 除非另有说明，本文描述的方法可使用分子生物学（包括重组技术）、细胞生 物学、生物化学、和微阵列和测序技术的常规技术和说明，其在本领域熟练技术人员能 力范围内。此类常规技术包括聚合物阵列合成、寡核苷酸的杂交和连接、寡核苷酸的测 序、和利用标记的杂交的检测。可通过参考本文的实例获得合适的技术的特别说明。但 是，当然也可使用等价的常规程序。在标准实验室手册中可找到此类常规技术和说明， 所述标准实验室手册诸如Green，等人编辑，GenomeAnalysis:ALaboratoryManual Series(Vols.I-IV) (1999) ;Weiner,等人，编辑，GeneticVariation:ALaboratory Manual(2〇〇7) ;Dieffenbach，Dveksler，编辑，PCRPrimer:ALaboratoryManual(2〇〇3); Bowtell和Sambrook,DNAMicroarrays:AMolecularCloningManual(2003)； Mount,Bioinformatics:SequenceandGenomeAnalysis(2004);Sambrook和 Russell,CondensedProtocolsfromMolecularCloning:ALaboratoryManual(2006)； 以及Sambrook和Russell，MolecularCloning:ALaboratoryManual(2002)(全部 来自ColdSpringHarborLaboratoryPress) ;Stryer,L.，Biochemistry(第四版） ff.H.Freeman,NewYork(1995) ；Gait,"OligonucleotideSynthesis:APractical Approach"IRLPress,London(1984)；Nelson和Cox,Lehninger,Principlesof Biochemistry,第三版，W.H.FreemanPub. ,NewYork(2000);和Berg等人，Biochemistry, 第五版，W.H.FreemanPub.，NewYork(2002)，为了所有目的通过引用将其所有并入本文。 在描述本组合物、研宄工具和方法之前，要理解本发明不局限于描述的特定的方法、组合 物、目标和用途，因为这些当然可变化。还要理解，本文使用的术语只是为了描述特定方面 的目的并且不是意图限制本发明的范围，本发明的范围将只由所附的权利要求限制。
[0037] 应注意，如本文以及在所附的权利要求中使用的，单数形式"一（a) "、"和（and) " 和"该（the)"包括复数指代对象，除非上下文另有清楚的指示。因此，例如，提及"核酸区 域"指一个、多于一个此类区域、或其混合物，并且提及"测定"包括提及本领域技术人员已 知的等价步骤和方法，等等。
[0038] 在提供值的范围的情况下，要理解，在该范围的上限和下限之间的每个介于中间 的值以及在该陈述范围中的任何其它陈述或介于中间的值被包括在本发明内。在陈述的 范围包括上限和下限的情况下，排除这些包括的限值中的任一个的范围也被包括在本发明 中。
[0039] 为了描述和公开在出版物中描述的制剂和方法的目的，通过引用将本文提到的所 有出版物并入，并且其可与本文描述的发明关联使用。
[0040] 在以下的说明中，列出了很多具体细节以提供本发明的更彻底的理解。但是，对于 本领域技术人员来说将清楚的是，本发明可被实施而无这些具体细节中的一个或更多个。 在其它的情形中，为了避免模糊本发明，本领域技术人员熟知的特征和程序未被描述。
[0041] 定义
[0042] 除非清楚的声明，本文使用的术语意图具有如由本领域普通技术人员所理解的清 楚且普通的意义。以下定义意图帮助读者理解本发明，但并非意图改变或者以其他方式限 制此类术语的意义，除非另有声明。
[0043] 术语"扩增的核酸"为其量与其起始量相比已通过体外进行的任何核酸扩增或复 制方法增加了至少两倍的任何核酸分子。
[0044] 术语"怀孕母本"指由于利用来自不同的妇女的人卵母细胞而怀有胎儿的妊娠妇 女。
[0045] 术语"染色体异常"指染色体的全部或部分的任何遗传变异。遗传变异可包括但 不局限于诸如加倍或缺失、易位、倒位、和突变的任何拷贝数变异。
[0046] 术语"互补的"或"互补性"被用来指通过碱基配对原则相关的核酸分子（即，核 苷酸序列）。互补的核苷酸通常地为A和T(或A和U)、或C和G。当一条链的核苷酸以最 佳的方式对齐并且具有适当的核苷酸插入或缺失，以至少约90%至约95%的互补性、并且 更优选地从约98%至约100%的互补性、并且甚至更优选地以100%的互补性配对时，两条 单链RNA或DNA分子被称为基本上互补。可选地，当在选择性杂交条件下RNA或DNA链将 与其互补物杂交时，存在基本上互补。选择性杂交条件包括但不局限于严格杂交条件。严 格杂交条件将通常地包括小于约1M、更通常地小于约500mM并且优选地小于约200mM的盐 浓度。杂交温度通常地为比解链温度（TJ低至少约2°C至约6°C。
[0047] 术语"修正标志"指可包含允许鉴定和修正扩增、测序或其它实验性错误的另外的 核苷酸的标志，所述鉴定和修正包括检测在测序期间一个或更多个碱基的缺失、取代或插 入以及可在测序之外诸如寡核苷酸合成、扩增、和测定的任何其它方面发生的核苷酸改变。 这些修正标志可以是为单独的序列的独立标志，或其可被嵌入其它标志内以帮助证实所使 用的实验技术的准确性，例如，修正标志可以是基因座标志或鉴定标志的一组序列。
[0048] 如本文使用的术语"诊断工具"指例如如在系统中联合使用的本发明的任何组合 物或测定以对患者样品进行诊断测试或测定。
[0049] 术语"卵子供体妊娠"指由于利用并非来自怀孕母本的人卵母细胞而导致的妊娠。
[0050] 术语"杂交"通常地意思是互补的核酸链藉以发生配对的反应。DNA通常地是双链 的，并且当链是分开的时，在适当的条件下其将重新杂交。杂合体可在DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA之间形成。其可在短链和含有与短链互补的区域的长链之间形成。不完全杂合体 也可形成，但是其越不完全，其将越不