一种唾液腺类器官和类腺泡的体外构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织和器官再造技术领域，具体涉及一种基于人小涎腺成体干细胞的生物工程化的唾液腺类器官和类腺泡的体外构建方法。
【背景技术】
[0002]已有研宄证实大唾液腺组织含有间充质干细胞和上皮干细胞。人的唾液腺主要有三个大唾液腺及分布于口腔粘膜下的许多小涎腺，他们都是由实质(腺泡，导管)和间质(结缔组织，血管、淋巴管和神经等)组成。关于唾液腺中干细胞的研宄主要集中于大唾液腺，已有实验证实人腮腺中存在间充质干细胞并能在体外诱导分化为成骨、成脂和成软骨细胞。这成为间充质干细胞的又一新的来源。有文献报道从鼠颁下腺中分离得到的多能祖细胞(SGP)具有干细胞特征并能分化为内胚层系细胞，通过门静脉植入肝脏，发现这些细胞融入肝小梁并可以分泌白蛋白。也有实验从鼠科动物颁下腺分离唾液腺细胞在体外用floating sphere culture system方法培养，其中包含表达干细胞标记Sca_l，c_Kit和Musash1-1的细胞，并证实这些干细胞来源于导管上皮。在体外这些细胞分化为唾液腺导管细胞及分泌粘液素和淀粉酶的腺泡细胞。用C-Kit为标记流式细胞仪分选富集干细胞，体外这些细胞分化为分泌淀粉酶的腺泡细胞。体内小数量C-Kit+细胞腺内注射移植导致唾液腺形态和功能的长期恢复。说明唾液腺中含两种干细胞即间充质干细胞和上皮干/祖细胞。虽然这些研宄证实在大唾液腺组织里有这两种干细胞，但是临床上很难从大唾液腺比较容易的获得适量的组织分离培养这些干细胞。
[0003]唇粘膜下小涎腺与大唾液腺组织具有同源性:临床上在八十年代就开始切取唇粘液腺进行活检来诊断一些大唾液腺的疾病，这说明了小涎腺与大唾液腺的同源性。唇粘膜下小涎腺的细胞组成成分和大唾液腺相同，都是由腺泡细胞、导管上皮细胞、肌上皮细胞和间充质细胞等组成，从理论上讲，小涎腺组织也应含上述两种干细胞。
[0004]唇粘膜下小涎腺分布广泛，来源丰富，取材容易，手术创伤微小，供区隐蔽，切取后基本上不影响供区功能。我们最早报道了从人小涎腺组织获取成体干细胞的报道。因此，研宄从人小涎腺组织分离培养鉴定成体干细胞并进行定向诱导分化，可以为临床上干细胞治疗或组织工程提供新的种子细胞来源。
[0005]类器官单位是在细胞外基质中体外三维培养形成的具有组织中各细胞类型的结构，该方法广泛应用于小肠干细胞及组织工程构建的研宄中。有文献报道，分离Lgr5+的小肠干细胞，在Matrigel中可分化形成类器官单位。对该类器官单位检测后发现，其具有不同的细胞类型，包括小肠上皮细胞，粘液分泌细胞和内分泌细胞，并可观察到类肠腔结构。以此为基础，研宄者们进行了组织工程小肠和各类干细胞增殖及分化的研宄。最近，有学者从鼠胚胎13.5天到14天的颁下腺腺基组织中获取上皮细胞和间充质细胞，将两种细胞放在一起进行体外三维培养，三天后形成生物工程化的唾液腺芽，然后原位移植于颁下腺或腮腺部位，移植30天后在体内形成成熟的具有功能的唾液腺。
[0006]所述间充质干细胞培养基为MSCM培养基。
[0007]所述角质细胞培养基为KM培养基。
[0008]尚没有研宄采用人小涎腺成体间充质干细胞和人小涎腺成体上皮干/祖细胞混合三维培养获得人唾液腺类器官，或单纯用人小涎腺成体上皮干/祖细胞进行三维培养，获得人唾液腺类腺泡组织的研宄报告。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种基于人小涎腺成体干细胞的生物工程化的唾液腺类器官和类腺泡的体外构建方法。
[0010]一种唾液腺类器官和类腺泡的体外构建方法，按照如下步骤进行:
[0011](I)从人小涎腺组织中通过组织块培养法获得小涎腺成体间充质干细胞和成体上皮干/祖细胞；
[0012](2)分离培养小涎腺间充质干细胞和小涎腺上皮干/祖细胞，进行体外扩增；或者分离培养人小涎腺成体上皮干/祖细胞，进行体外扩增；
[0013](3)在基底膜基质胶中对小涎腺间充质干细胞和小涎腺上皮干/祖细胞进行混合三维培养，获得人唾液腺类器官；或者在基底膜基质胶中对人小涎腺上皮干/祖细胞进行三维培养，获得人唾液腺类腺泡组织。
[0014]所述基底膜基质胶为细胞外基质Matrigel。
[0015]进一步的，所述在基底膜基质胶中对小涎腺间充质干细胞和小涎腺上皮干/祖细胞进行混合三维培养的具体操作步骤为:将培养至三代或三代以上的小涎腺间充质干细胞和上皮干/祖细胞消化成单细胞，按细胞数量1:1混合后接种于Matrigel中，使用等比例混合的间充质干细胞培养基和角质细胞培养基进行培养，具体操作为胰酶消化间充质干细胞和上皮干/祖细胞为单细胞悬液，计数后用培养基重悬，并与等体积4°C解冻的Matrigel混合，接种于24孔板，置于37°C细胞培养箱，20分钟后，待Matrigel凝固，加入培养基，每孔接种2.5 X 15小涎腺间充质干细胞和2.5 X 10 5小涎腺上皮干/祖细胞，与50 μ LMatrigel混合后接种，接种成功后，隔天换液，体外培养I天后，细胞聚集成分支形状，3天后，可见到腺泡状和管状分支结构的类器官形成。6-10天可以长到最大，6天后可换用唾液腺培养基以促进其分化成熟。
[0016]进一步的，所述在基底膜基质胶中对人小涎腺上皮干/祖细胞进行三维培养的具体操作步骤为:将培养至三代或三代以上的小涎腺上皮干/祖细胞消化成单细胞，接种于Matrigel中，使用角质细胞培养基进行培养，具体操作为胰酶消化上皮干/祖细胞为单细胞悬液，计数后用培养基重悬，并与等体积4°C解冻的Matrigel混合，接种于24孔板，置于37°C细胞培养箱，20分钟后，待Matrigel凝固，加入培养基，每孔接种5 X 14小涎腺上皮干/祖细胞，与50 μ L Matrigel混合后接种，接种成功后，隔天换液，接种后4小时，细胞呈环形的极性排列，10小时后，形成类腺泡的球形体。6-12天后类腺泡球形体可以长到最大。6天后可以换用唾液腺培养基以促进其分化成熟。
[0017]本发明的有益效果:本发明的方法用人小涎腺成体间充质干细胞和人小涎腺成体上皮干/祖细胞混合接种在在细胞外基质Matrigel上进行三维培养获得人唾液腺类器官，或单纯用人小涎腺成体上皮干细胞/祖在细胞外基质Matrigel上进行三维培养，获得人唾液腺类腺泡组织。本发明取材来源广泛，易于切取，创伤微小，口内供区隐蔽，从成体组织中取材，可以通过体外扩增用于自体移植。本发明对于体外或体内唾液腺的生长发育研宄、唾液腺疾病模型的研宄、唾液的生理功能和病理变化的研宄、唾液腺疾病的治疗等具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0018]图1为本发明人小涎腺上皮干/祖细胞与间充质干细胞混合培养在Matrigel上的光镜图。
[0019]图2为本发明人小涎腺上皮干细胞培养在Matrigel上的光镜图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
[0021]实施例1
[0022]培养过程中用到的方法与试剂:
[0023](I)原代细胞的培养:DMEM/F12添加10%胎牛血清，I %双抗和I %谷氨酰胺；
[0024](2)体外扩增:
[0025]I)人小涎腺间充质干细胞培养:间充质干细胞培养基:DMEM/F12添加5%胎牛血清，1%双抗，以及 BSA 10 μ g/mL, apo-transferrin 10 μ g/mL，insulin 5mg/mL，EGF 2ng/mL，FGF-2 2ng/mL 和 hydrocortisone lmg/mL.
[0026]2)人小涎腺上皮干/祖细胞培养:角质细胞培养基
[0027]DMEM/F12 添加 BSA (牛血清白蛋白)5 μ g/mL, transferrin (转铁蛋白)5 μ g/mL，ΒΡΕ (牛垂体提取物)5O μ g/mL, insulin (胰岛素)3.75g/mL, FGF-2 3ng/mL，EGFIng/mL，epinephrine (肾上腺素)500ng/mL，hydrocortisone (氢化可的松)0.5g/mL，Prostaglandin E2 (前列腺素 E2) 10 8M and T3 30nM。
[0028]3)唾液腺类器官构建和腺泡构建:细胞外基质MatrigelTM(BD，US)、唾液腺类器官(或类腺泡)培养基:
[0029](I) DMEM/F-12 (1:1)添加 10 % fetal bovine serum, 100U mF^enicillin,100 μ g IiirlStreptomycin, I %谷氨酰胺。
[0030]或(2)DMEM/F121: 1,10 % fetal bovine serum(FBS)，I % penicillin/streptomycin,I % insulin-transferrin-selenium supplement,1mM nicotinamide，IXlCT7M dexamethasone，lmMb-mercaptoethanol，20mg/l epidermal growth factor (EGF)and 20mg/l hepatocyte gro