一个特异响应渗透胁迫信号的启动子及应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一个能够特异响应渗透胁迫信号的启动子序列。本发明还涉及该启动 子在发酵工业微生物菌株遗传改造、提高发酵效率方面的应用。
【背景技术】：
[0002] 高密度培养基因工程菌的表达产物，是提高微生物产量和目的基因表达产物浓度 的有效手段。因为利用普通浓度进行发酵时，表达产物量在菌体内和发酵液中的浓度比较 低，难以获得理想的生产效率和经济效益。但是，高密度培养造成了高渗透胁迫的环境。因 为，高密度的生物量需要投入几倍的基质，而高浓度的底物和产物形成的高渗透胁迫是影 响微生物生理功能充分发挥的最为重要的关键因素，将会导致发酵过程产物浓度和生产强 度无法进一步提高。
[0003] 因此，发现能够特异响应渗透胁迫信号的启动子序列，并将其用于发酵工业微生 物菌株遗传改造，以增强微生物对渗透胁迫环境的响应效率与适应能力，有效消除由于渗 透压增高引起的抑制是高密度培养需要解决的问题。
[0004] 许多细菌非编码RNA在细胞应激反应过程中能够高效表达，进而在细菌的胁迫应 答反应系统中发挥着重要的调节作用。例如，nfiS基因是可转录的有功能性的非编码RNA 基因，本申请人以往的研宄显示该基因在提高菌株氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性方面具有调 节功能（专利【申请号】201410262604. 3)。但现有技术并未发现nfiS基因的启动子作为功 能元件在特异响应渗透胁迫信号方面的功能。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是得到一个能够特异响应渗透胁迫信号的启动子序列，在渗透胁迫 条件下该启动子能够有效启动目的基因的翻译，以应用于微生物工业发酵菌株的遗传改 造。
[0006] 本发明首次发现了非编码RNA nfiS基因具有特异响应渗透胁迫信号的功能，体外 表达分析表明，该非编码RNA能够特异的响应山梨醇渗透胁迫信号（图1)。
[0007] 本发明是通过以下工作得到上述启动子序列，并证实其功能：
[0008] 1、分析和确定nfiS基因启动子
[0009] 通过5' -RACE实验确定nfiS的转录起始位点和方向。结果表明nfiS的转录起始 位点始于一个腺嗓呤（A)，确定从该转录起始位点起上游153bp的基因区域为nfiS基因的 启动子，命名为pnfiS(图2)，其核苷酸序列是SEQ ID NO :1。
[0010] 2、构建nfiS基因启动子pnfiS融合表达载体，并分别转入四种不同细菌，获得四 种重组表达菌株
[0011] (1)构建pnfiS融合表达载体
[0012] 首先进行PCR扩增，获得完整的启动子片段pnfiS，然后将克隆片段进行BamHI和 HindIII双酶切，插入到启动子表达载体p⑶926的多克隆位点处即报告基因 IacZ前，获得 本发明启动子与IacZ基因的融合表达载体pnifS-IacZ (图3);
[0013] (2)将该表达载体分别转入四种菌中：
[0014] 固氮施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri)、大肠杆菌（Escherich col i)、 苏云金芽抱杆菌（Bacillus thuringiensis)或谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)
[0015] (3)获得四种重组表达菌株：
[0016] P. stutzeri (pnfiS-lacZ) ；E. coli (pnfiS-lacZ)； B.thuringiensis(pnfiS-lacZ) ;C. glutamicum(pnfiS-lacZ)〇
[0017] 3、pnfiS对渗透胁迫信号的响应的验证实验
[0018] 分别将上述四种重组表达菌株加入不同浓度的高渗透性山梨醇溶液中，测定在诱 导条件下重组菌中IacZ基因编码产物β-半乳糖苷酶的酶活。在四株重组菌中，山梨醇均 能够激活本发明启动子的表达，进而启动IacZ基因的有效翻译。
[0019] 本发明的有益效果
[0020] 实验证实，在渗透胁迫条件下，本发明所述启动子无论是在假单胞菌中还是3株 工业微生物发酵菌株中都能够特异、高效的启动目的基因的表达。
[0021] 本发明的启动子序列可以用于不同细菌中异源基因的有效表达，因此可应用于微 生物发酵工程菌株的遗传改造、提高发酵目的产物产量等方面。
【附图说明】
[0022] 图1 :非编码RNA nfiS对不同胁迫信号响应的分析。
[0023] 图中纵坐标表示非编码RNA基因 nfiS在mRNA水平上的相对表达量，横坐标代表 P. stutzeri A1501菌株不同诱导条件。其中黑色柱状图代表正常LB培养基条件下非编码 RNA nfiS基因的表达量；波浪柱状图代表300mM SorbitoK山梨醇）胁迫条件下非编码RNA nfiS基因的表达量；网格柱状图代表0.05% SDS(sodium dodecyl sulfate,十二烷基硫酸 钠）胁迫条件下非编码RNA nfiS基因的表达量。
[0024] 图2 :固氮施氏假单胞菌A1501中非编码RNA nfiS基因的启动子分析。
[0025] 图中nfiS基因的转录起始位点用下划线表示，转录方向用箭头表示。启动子序列 用黑色粗体表示。
[0026] 图3 :启动子pnfiS与目的基因融合表达示意图。
[0027] 图中基因转录方向用箭头表示，其中a图表示pnfiS与报告基因 IacZ融合表达示 意图，启动子用pnfiS表示，插入位点为B(BamHI)和H(Hindm)，报告基因用IacZ表示；图 中b图表示pnfiS与其他目的基因融合表达模式图，其中启动子用pnfiS表示，目的基因用 target gene 表不。
[0028] 序列信息
[0029] 非编码RNA(nfiS)编码基因的启动子PnfiS核苷酸序列SEQ ID NO: 1
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本 发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技 术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0031] 实施例1非编码RNA nfiS对胁迫信号的响应
[0032] (1)将A1501菌在LB液体培养基中活化，30°C过夜培养；
[0033] (2)次日转接至LB培养基中30 °C培养至OD6tl产0· 6 ;
[0034] (3)首先各取Iml菌体，作为对照，然后再各取Iml菌体加入终浓度为0. 3M山梨醇 或0.05%505,37°〇，200印111摇床培养6011^11;
[0035] (4) 8000rpm 离心 5min，收集菌体；
[0036] (5)采用Promega大量提取RNA试剂盒Z3741提取细菌总RNA，将使用量相同的样 品RNA进行单链DNA (cDNA)反转；
[0037] (6)通过qRT-PCR方法对nf iS基因在不同胁迫条件下的表达水平进行了分析，发 现山梨醇胁迫条件下nfiS的转录水平显著提高，SDS胁迫条件下nfiS的转录水平没有显 著变化，表明nfiS能够特异的感应山梨醇渗透胁迫信号（图1)。
[0038] 实施例2nfiS基因启动子分析
[0039] 米用 Invitrogen 公司的 5' -RACE 试剂盒（5, RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0)。具体步骤如下：
[0040] (I)提取总 RNA
[0041] (2)合成第一条cDNA链
[0042] a、加如下组分于一 0· 5ml离心管（或PCR管）中，混匀
[0043] GSP1L/R.............................................................. .....2. 5pmoles (~IOto 25ng)
[0044] DEPC-treated water.....................sufficient for a final volume of 15. 5 μ I(or sterile, distilled water)
[0045] b、70°C孵育lOmin，冰浴lmin，短暂离心后依次加入下列组分
[0046] IOX PCR buffer....................................................... ................2. 5 μ I
[0047] 25mM MgCl2............................................................ ...............2. 5 μ I
[0048] IOmM dNTP mix........................................................ ................I μ I
[0049] 0.1 M DTT............................................................. ....................2. 5 μ I
[0050] final volume......................................................... ....................8. 5 μ I
[0051] The final volume of step land 2is 24 μ I.
[0052] c、轻轻混匀，短暂离心，42°C孵育Imin
[0053] d、加 1 μ I Super Script? II RT，轻轻混匀，42°C孵育 50min
[0054] 反应体系最终组成如下：
[0055] 20mM Tris-HCl (pH 8.4)
[0056] 50mM KCl
[0057] 2. 5mM MgC12
[0058] IOmM DTT
[0059] IOOnM cDNA primer (GSPl)
[0060] 400 μ M each dATP, dCTP, dGTP, dTTP
[0061] 1-5 μ g (~40ng/ μ I) RNA
[0062] 200units SuperScript?II RT
[0063] e、7(TC，15min 终止反应
[0064] f、离心10_20s后将反应体系至于37°C下
[0065] g、加 1 μ I of RNase mix，轻柔充分混勾，37°C孵育 30min
[0066] h、短暂离心聚集反应液，置冰上
[0067] (3) S. N. A. P 柱纯化回收 cDNA
[0068] a、室温下，binding solution 平衡柱子
[0069] b、每份待纯样品分装~100 μ I DEPC-treated water，65°C预热备用
[0070] c、加 120 μ I binding solution(6M NaI)于 the first strand reaction 中
[0071] d、将 cDNA/Nal solution 转至 S. N. A. P 柱，13, OOOx g 离心 20s
[0072] e、取出离心柱，将离心液转至一小离心管中保存，知道确保成功回收到cDNA。把纯 化柱再放回收集管中。
[0073] f、加 0· 4ml (4°C预冷的）lx washing buffer 于离心柱中 13, OOOx g 离心 20s 倒掉 离心液，如此再重复洗三次
[0074] g、加400 μ I (4°C预冷的）70%乙醇于离心柱中13, OOOx g离心20s倒掉离心液， 洗两次
[0075] h、13, OOOx g离心Imin除去残余乙醇
[0076] i、将纯化柱转至一新回收管中，加入50 μ 1 65 °C预热DEPC-treated water 13, OOOx g离心20s收集洗脱出的cD