一个新型细菌抗逆功能基因及其表达产物与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一个新型细菌抗逆功能基因及其表达产物应用。
【背景技术】
[0002] 长期暴露于不同类型或不同来源环境刺激物诱发的活性氧自由基（ROS)胁迫下， 促使细胞乃至整个机体进化出一套强有力对抗氧化应激损伤的抗氧防御机制，来防止ROS 及其代谢产物对机体的有害影响，这些抗氧防御机制除了直接对内源性ROS的产生进行 调控外，还可通过细胞内的抗氧化物酶系统和小分子量抗氧化剂（Low Molecular Mass Antioxidant，LMMA)来清除过多的R0S。其中，小分子量抗氧化剂LMMA作为生命系统中 一种重要的抗氧化剂，能保护细胞远离ROS直接或间接诱发产生的氧化危害，维持着细胞 内氧化还原平衡和蛋白硫醇/二硫化物的正常比率。LMM拥有很多抗氧化酶所没有的优 势，例如LMM是小分物质，很容易渗透通过细胞内的膜结构，从而与其作用的靶点更加接 近。此外，细胞自身还能调节LMM的浓度，同时对于多种ROS都具有很强的清除能力。而 且LMM的作用效果具有协同性，LMM之间的内部关联对于抗氧胁迫极为重要。这种小分 子量抗氧化剂的内在来源是生物合成和生物反应过程中产生的，除了乙酰辅酶A(CoA)和 半胱氨酸（Cys)外，现在发现的生物体内LWMA主要有谷胱甘肽（glutathione，GSH)、卵类 硫醇（0v〇thiol，0SH)、麦角硫醇（Ergothioneine，ESH)、芽抱硫醇（Bacillithiol，BSH)、分 枝硫醇（Mycothiol，MSH)等小分子量硫醇。其中MSH在发挥抗氧胁迫功能的时候会对一 些蛋白进行硫醇化修饰，蛋白S-硫醇化修饰是机体应对氧化应激的一种重要的硫醇保护 和氧化还原开关机制，是机体在氧化应激应答下一种翻译后的可逆修饰。S-硫醇化修饰是 硫醇与蛋白巯基之间形成的混合二硫键，可避免蛋白活性位点Cys过度氧化成不可逆的磺 酸，一旦胁迫结束，混合二硫键又可被相关的酶还原而恢复到正常巯基状态。
[0003] 目前，研宄发现MSH合成缺陷的谷氨酸棒杆菌突变株对诱发ROS产生的抗生素、氧 化剂、重金属及烷化剂等极为敏感，这说明MSH涉及细胞的保护作用，即S-分枝硫醇化修饰 可能存在。谷氨酸棒杆菌除了作为系统生物学研宄中的典型模式生物外，更是一种在发酵 工业中得到广泛应用的重要的工业微生物，主要用于氨基酸、维生素、核苷酸等的生产。谷 氨酸棒杆菌自身不具备合成GSH的代谢途径，而是以MSH为胞内主要硫醇，研宄表明MSH 的生理功能相似于GSH，也能维持胞内的氧化还原平衡，涉及活性氧和活性氮、抗生素、氧化 剂、烷化剂、重金属、酸、有机溶剂、芳香化合物和异源物质的清除或解毒；并且MSH过量合 成可明显提高谷氨酸棒杆菌在多种环境应激下的鲁棒性和存活率，显然对抗逆境的鲁棒性 决定了谷氨酸棒杆菌生产性能的优劣，MSH的抗环境胁迫性能就成为塑造谷氨酸棒杆菌生 物鲁棒性的重要手段。因此，如何提高该菌在逆境下的鲁棒性也成为众多研宄的中心问题。 谷棒中分支硫醇过氧化物酶MPx与含硫的谷胱甘肽过氧化物酶具有很高的序列相似性，通 过使用不同的质子给予体分析它潜在的过氧化物酶活性来研宄分支硫醇过氧化物酶的功 能，分支硫醇过氧化物酶Mpx通过Trx/TrxR系统以及Mrxl/Mtr/MSH再生系统降低过氧化 氢和烷基过氧化氢的含量，然而，仅MSH不能有效的降低分支硫醇过氧化物酶，分支硫醇过 氧化物酶体系的催化机制涉及Cys36与Cys79之间的内部二硫键的形成，这个二硫键是与 硫氧还蛋白相互作用的枢纽，对于分枝硫醇氧化还原酶系统来说，催化循环涉及经单硫醇 反应机理Cys36次磺酸硫醇化修饰与去硫醇化修饰。Mpx的表达显著增强细菌对各种过氧 化物的耐受性，降低蛋白质的羰基化和细胞内活性氧类物质的积累，Mpx的表达直接受胁迫 应答的ECF转录起始因子SigH的激活。由此可见，谷氨酸棒状杆菌中分支硫醇抗氧化物酶 (Mpx)代表着一种既利用Mrx又利用Trx还原系统的新的谷胱甘肽过氧化物酶类型，谷氨酸 棒状杆菌中分支硫醇抗氧化物酶（Mpx)的合成对于其抗氧胁迫具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，提供一个新型细菌抗逆功能基因及其表达产物与 应用，该细菌抗逆功能基因的表达产物分支硫醇抗氧化物酶MPx，可显著增强细菌的抗逆 性。
[0005] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
[0006] 本发明之一个新型细菌抗逆功能基因，其核苷酸序列如SED ID NO: 1所示。
[0007] 本发明之一种分支硫醇抗氧化物酶MPx，由所述新型细菌抗逆功能基因编码的蛋 白，氨基酸序列如SED ID NO: 2所示。
[0008] 本发明之一种分支硫醇抗氧化物酶MPx的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)获得目的基因：以含MPx基因的谷氨酸棒状杆菌的基因组DNA为模板，按基因 序列设计一对引物，
[0010] Mpx-F ：CGCGGATCCATGACTTCTATTCATGACATC (下划线为 BamHI 的酶切位点），如 SED ID NO :3 所示；
[0011] Mpx-R :ACGCGTCGACTTAGATAGGGAGATTCTCCTC (下划线为 Sail 的酶切位点），如 SED ID NO :4所示，在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，经PCR循环获得所需基因片 段，如SED ID NO :1所示；
[0012] (2)构建重组表达载体：提取表达质粒后，用限制性内切酶BamHI和Sail进行双 酶切，酶切产物经琼脂糖电泳后，切胶回收；在T4 DNA连接酶作用下与载体pET28a连接；
[0013] (3)获得含重组表达质粒的表达菌种：将步骤（2)中所述连接产物转化大肠杆菌 E. coli JM109,根据重组载体的抗Km特性，菌落per验证，碱裂解法抽提质粒，双酶切初步 鉴定；测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，然后以重组质粒DNA转化表达宿 主菌BL21(DE3)的感受态菌株中；
[0014] (4)诱导靶蛋白的表达及蛋白的纯化：将含有重组质粒的E. coli BL21(DE3)菌株 接种到LB液体培养基中，37°C、160~220rpm摇床培养到006(|(|为0. 4~0. 6,接着加入终浓 度为(λ 5~(λ 7mM IPTG，18~26°C，160~220rpm摇床诱导表达8~10小时；4°C离心