低温诱导高效异源表达载体pSW4及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉一种穿梭质粒的最小化及其应用,具体是涉及一种以噬菌体为基础的穿 梭质粒PSW2最优化改造和应用。
【背景技术】
[0002] 本发明基于改造了一株专利CN103333908A所述质粒PSW2,其来源于深海 细菌希瓦氏菌WP3 (Shewanellapiezotolerans WP3)的丝状菌体(已经发表于 《shewanellapsychrophila sp.nov. and Shewanellapiezotolerans sp.nov. , isolated from west Pacific deep-sea sediment》,2007)。卩莖菌体是一种专以细菌为宿主的病毒, 其遗传物质由蛋白质外壳所包裹。当噬菌体SWl侵染WP3时,它可以整合到WP3的基因组 上,也可以产生双链的复制形式,以此为基础将其改造成为适应宿主WP3的天然质粒载体。 本专利改造的专利CN103333908A所述质粒pSW2,其基因组全才度为6451bp,含有6个可能 的开放阅读框,编码与其生命活动相关的蛋白组分,如噬菌体复制单元,结构单元,组装单 元与调控单元。
[0003] 低温表达体系不仅能大大降低蛋白包涵体的形成,并且能够显著提高异源蛋白的 稳定性,特别见于一些热敏感蛋白。深海细菌Shewanella piezotolerans WP3分离自深海 低温沉积物,表现出明显适应低温的特性,其最适生长温度为20°C,在4°C下也具有很高的 生物量。WP3的天然噬菌体SWl具有低温诱导的特性,在4°C条件下蛋白表达量相较于20°C 有显著提高。以此为基础,专利CN103333908A所述质粒pSW2可作为适应宿主WP3的低温 诱导的异源表达载体,同时也适用于本底表达深海来源的异源蛋白。
[0004] 目前,在大肠杆菌和希瓦氏菌中都能够复制表达的以噬菌体为基础的穿梭质粒只 在专利CN103333908A所述质粒PSW2所报导,虽然PSW2可以表达异源蛋白,但是其低温诱 导效率偏低,并且其质粒存在许多累赘片段,其存在既消耗能量降低蛋白表达量且降低载 体通载量。因此,对其改造有很大的实际的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于将一种既能够在大肠杆菌内复制表达、也可以在不同的希瓦氏 菌中复制表达的以噬菌体为基础的穿梭质粒PSW2优化,同时提供以GFP为报告基因的高 效异源表达筛选载体。本发明还提供了制备上述PSW4及其衍生质粒的方法和其应用。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0007] 第一方面,本发明提供一种以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW4,其碱基序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0008] 所述穿梭质粒pSW4是以专利CN103333908A所构建的载体pSW2为基础,改造优化 成为低温诱导高效异源表达载体。
[0009] 第二方面,本发明提供一种所述穿梭质粒pSW4的构建方法,包括以下步骤:
[0010] 步骤一,敲除质粒pSW2上FpsB序列;
[0011] 步骤二,启动子PR1869及RBS序列的克隆;
[0012] 步骤三,His-Tag的克隆;
[0013] 步骤四,连接报告基因 GFP筛选高效表达株。
[0014] 优选的,在步骤一中,所述FpsB序列预测为单链结合蛋白(SSB,ssDNA binding protein)〇
[0015] 优选的,在步骤二中,所述启动子PR1869来源于WP3的冷激蛋白(Cold shock protein)〇
[0016] 优选的,在步骤三中,所述His-Tag来源于序列合成。
[0017] 优选的,在步骤四中,所述GFP为绿色焚光蛋白(green fluorescent protein)。
[0018] 第三方面,本发明提供一种所述以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW4的衍生质粒的 构建方法,包括以下步骤:
[0019] 步骤一,在专利CN103333908A所述穿梭质粒pSW2的多克隆位点引入GFP作为报 告基因;
[0020] 步骤二,质粒扩增验证并转化于感受态WM3064菌株,菌落PCR扩增验证;
[0021] 步骤三,以深海细菌希瓦氏菌WP3作为低温蛋白表达宿主,将突变型 WM3064-pSW3-GFP与希瓦氏菌WP3接合转移;
[0022] 步骤四,用酶标仪分别测定20°C与4°C下GFP的表达强度,筛选高效表达株;以对 比改造后PSW3与原始pSW2对目的蛋白的表达率影响。
[0023] 第四方面,本发明提供一种所述以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW4在利用外源基 因表达低温蛋白中的应用。
[0024] 本发明还提供了一种上述以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW4在希瓦氏菌中基因回 补的应用。
[0025] 本专利在已有专利CN103333908A所构建的载体pSW2为基础对其进行最优化改造 以增大通载量以及提高质粒稳定性和异源表达效率,其构建穿梭质粒能够在多种宿主细胞 内复制并表达外源蛋白。同时本专利运用绿色焚光蛋白(green fluorescent protein),简 称GFP,其基因所表达的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色荧光,故可以作 为基因表达的报告基因,进行最小化删减。构建PSW4,能够在低温下更高效的表达外源蛋 白。高效的低温启动子配合宿主菌WP3的低温生长特性,为表达热敏蛋白提供了一个新的 工具。
[0026] 与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
[0027] (1)低温诱导外源蛋白表达实现不通过诱导剂而仅仅依靠温度改变来实现蛋白诱 导,可用于原位表达深海来源的蛋白等。
[0028] (2)该穿梭质粒在4°C条件下大大降低外源蛋白包涵体的生成,稳定蛋白性能,增 加了启动子序列后,PSW4相较于pSW2在20°C与4°C条件下GFP表达量都大大提升。
【附图说明】
[0029] 通过阅读参照以下附图对改造实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的 和优点将会变得更明显:
[0030] 图1是pSW4质粒改造说明图,
[0031] 图2是pSW2与pSW2 Λ FpsB大小对照图,
[0032] 图 3 是 pSW2 与 pSW2+PR1869+His-Tag 大小对照图,
[0033] 图4是pSW4质粒拷贝数的鉴定结果图,
[0034] 图5是不同温