使用羧基修饰的金纳米颗粒的超灵敏闭管式比色环介导等温扩增法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及特定核酸序列的简单检测方法。具体而言，本发明涉及将功能化的颗 粒，如羧基修饰的金纳米颗粒，用于能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系中，如用于环介导 的等温扩增方法中，以高灵敏度、低成本检测特定核酸序列的方法。
【背景技术】
[0002] 用简单方式对特定核酸序列进行检测，可以赋予现场护理（point-of-care)诊断 和现场病原体检测更大的价值。 [1]具有独特的比色性质的金纳米颗粒（AuNP)非常适合这 项任务。[2]AuNP在可见光区域表现出特有的表面等离子体共振（SPR)吸收带并且确切的频 谱依赖于颗粒间的距离。具体地，颗粒凝集引起SPR吸收带红移并伴随红色到紫色的颜色 变化。这一性质已用于特定核酸序列的液相比色检测。 M然而，先前所报道的检测平台并 不具备实际应用所需要的所有基本属性，包括高灵敏度、简单温度控制、低成本以及无携带 污染。这些平台绝大多数都使用寡核苷酸修饰的AuNP， [^d'4a'b'ig'6]影响可见颜色变化的一 个关键方面是靶序列的浓度必须在纳摩尔水平。 [3a_d]对于实际应用，需要更高的灵敏度。因 此一直努力致力于将基于AuNP的比色检测与靶扩增相耦合。在扩增方面，涉及简单温度控 制的等温技术 [5a_g]比热循环技术更可取。[4a，b，6]另一个主要问题是，对于所有的等温 [5]辅 助扩增平台和大多数热循环[4](存在3个例外[6])辅助扩增平台而言，扩增后不可避免地会 开管添加 AuNP探针（寡核苷酸修饰的和未修饰的两种），这存在高风险的携带污染。AuNP 探针与扩增反应的不相容性是由于热[6b'7]和/或二硫苏糖醇诱导的[8]寡核苷酸从AuNP上 解吸，之后酶非特异性地吸附到AuNP表面上（或只是后者作用于未修饰的AuNP [6b'9])。在3 个闭管平台（全部是基于热循环和寡核苷酸修饰的AuNP)中，具有实用灵敏度的2个需要 特别制备的寡核苷酸修饰的AuNP (二氧化娃包被的[6b]或三硫醇化（trithiolated)的寡核 苷酸[6e])。另外，寡核苷酸修饰的AuNP的另一个问题是巯基修饰的寡核苷酸成本高。
[0003] 环介导等温扩增法，英文名称为 loop-mediated isothermal amplification，是 一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种或者6种特定引物，在 链置换DNA聚合酶的作用下，60-65°C恒温扩增，15-60分钟左右即可实现10-9-10- 10倍的 核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。然而，环介导等温扩增方法也存在 缺点，由于其灵敏度高，一旦开盖容易形成携带污染。
[0004] 因此，本领域仍然需要低成本、高灵敏度、无携带污染的检测特定核酸序列的方 法。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一方面涉及一种试剂盒，其包括：1)功能化的颗粒，其具有可用于能够 产生焦磷酸离子的核酸扩增体系的比色和/或沉淀和/或荧光检测的性质，2)用于通过能 够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系检测样品中特定核酸序列存在的扩增引物，3)用于能够 产生焦磷酸离子的核酸扩增体系的其他组分和装置。
[0006] 在一些实施方式中，颗粒是具有任何依赖于粒子间距离来控制比色性质类的材 料，如金纳米颗粒或银纳米颗粒；或者
[0007] 颗粒是任何能通过与Mg2+螯合来控制颗粒分散和沉淀的材料，如金颗粒、银颗粒、 磁性颗粒、碳纳米管或氧化石墨烯；或者
[0008] 颗粒是具有任何依赖于粒子间距离来控制荧光性质类的材料，如量子点、荧光染 料参杂的二氧化硅纳米颗粒。
[0009] 在一些实施方式中，用于功能化的颗粒的功能化分子同时具有可以固定到颗粒的 官能团如巯基、氨基，和可以与Mg 2+形成螯合复合物且螯合的Mg2+可被P2O广提取出的官能 团如羧基、羟基、氨基、碳酸根、硫酸根、氟、磷酸根、硫代硫酸根。
[0010] 在另一些实施方式中，功能化的颗粒的功能化分子是简单的碳链，如11-巯基 十一烷酸（MUA)，或者是多聚物如聚乙二醇。
[0011] 在某些实施方式中，功能化的颗粒是功能化的纳米颗粒，如功能化的金纳米颗粒 (AuNP)，其中纳米颗粒粒径范围可以为，例如1-100纳米，如1-80纳米，如2-60纳米，如 5-50纳米，如10-30纳米，如15-20纳米，如1-5纳米，如2-6纳米，如60-80纳米，只要所述 纳米颗粒具有任何依赖于粒子间距离来控制比色和荧光的性质即可。
[0012] 在某些实施方式中，功能化的颗粒的功能化分子可以单一或者多种同时固定到 AuNP表面。
[0013] 在某些实施方式中，功能化的纳米颗粒为量子点（QD)，QD具有荧光标记性质，其 具有至少一个化学基团以与Mg 2+形成螯合复合物，例如量子点表面经过MUA功能化后形成 MUA-QD，可与MUA功能化的金纳米颗粒（MUA-AuNP) -起存在以控制荧光强度来实现特定核 酸序列的检测，其中MUA-QD作为报告剂，而MUA-AuNP作为猝灭剂。除了 QD以外，其它荧光 材料也可以用于本发明的体系。
[0014] 在一些实施方式中，能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系是环介导等温扩增 (LAMP)。其它会产生焦磷酸离子的扩增系统也可以用于功能化颗粒结合。
[0015] 在一些实施方式中，用于能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系的其他组分和装置 是本领域已知的用于能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系的其他组分和装置，如用于LAMP 的其他组分和装置。
[0016] 本发明的第二方面涉及如上所述的试剂盒在现场护理和现场核酸检测中的用途。
[0017] 在某些实施方式中，所述用途包括临床诊断、食品安全检测、环境监测和生物武器 剂检测。
[0018] 本发明的第三方面涉及如上述第一方面中所限定的功能化的颗粒用于能够产生 焦磷酸离子的核酸扩增体系以闭管式检测样品中特定核酸序列的用途，其中能够产生焦磷 酸离子的核酸扩增体系如环介导等温扩增（LAMP)。
[0019] 本发明的第四方面涉及一种检测样品中特定核酸序列的方法，其包括步骤：
[0020] a)获得待测的样品或其核酸；
[0021] b)针对待检测样品中的特定核酸序列设计的用于能够产生焦磷酸离子的核酸扩 增体系等温扩增（LAMP)的引物，或者使用已知的用于该特定核酸序列的用于能够产生焦磷 酸离子的核酸扩增体系的引物；
[0022] c)将步骤a)的样品或其核酸、步骤b)的引物、功能化的颗粒、用于能够产生焦磷 酸离子的核酸扩增体系的其他组分以适当量混合并在其相应装置中反应，功能化的颗粒具 有可用于能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系的比色和/或沉淀和/或荧光检测的性质， 其中步骤a)的样品或其核酸、步骤b)的引物、功能化的颗粒、用于能够产生焦磷酸离子的 核酸扩增体系的其他组分可以依次地、两种或多种预混合地或同时地加入总反应体系中；
[0023] d)可选地，观察反应结果，判断样品中是否有特定核酸序列的存在。
[0024] 在某些实施方式中，颗粒是具有任何依赖于粒子间距离来控制比色性质类的材 料，如金纳米颗粒或银纳米颗粒；或者
[0025] 颗粒是任何能通过与Mg2+螯合来控制颗粒分散和沉淀的材料，如金颗粒、银颗粒、 磁性颗粒、碳纳米管或氧化石墨烯；或者
[0026] 颗粒是具有任何依赖于粒子间距离来控制荧光性质类的材料，如量子点、荧光染 料参杂的二氧化硅纳米颗粒。
[0027] 在某些实施方式中，用于功能化的颗粒的功能化分子同时具有可以固定到颗粒的 官能团如巯基、氨基，和可以与Mg 2+形成螯合复合物且螯合的Mg2+可被P2O广提取出的官能 团如羧基、羟基、氨基、碳酸根、硫酸根、氟、磷酸根、硫代硫酸根。
[0028] 在一个实施方式中，功能化的颗粒的功能化分子是简单的碳链如11-巯基十一烷 酸（MUA)，或者是多聚物如聚乙二醇。
[0029] 在某些实施方式中，功能化的颗粒是功能化的纳米颗粒，如功能化的金纳米颗粒 (AuNP)，其中纳米颗粒粒径范围为例如1-100纳米，如1-80纳米，如2-60纳米，如5-50纳 米，如10-30纳米，如15-20纳米，如1-5纳米，如2-6纳米，如60-80纳米，只要所述纳米颗 粒具有任何依赖于粒子间距离来控制比色和荧光的性质即可。
[0030] 在某些实施方式中，功能化的颗粒的功能化分子可以单一或者多种同时固定到 AuNP表面。
[0031] 在某些实施方式中，功能化的纳米颗粒为量子点（QD)，QD具有荧光标记性质，其 具有至少一个化学基团以与Mg 2+形成螯合复合物，例如量子点表面经过MUA功能化后形成 MUA-QD，可与MUA功能化的金纳米颗粒（MUA-AuNP) -起存在以控制荧光强度来实现特定核 酸序列的检测，其中MUA-QD作为报告剂，而MUA-AuNP作为猝灭剂。除了 QD以外，其它荧光 材料也可以用于本发明的体系。
[0032] 在一个实施方式中，能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系是环介导等温扩增 (LAMP)。其它会产生焦磷酸离子的扩增系统也可以用于功能化颗粒结合。
[0033] 在某些实施方式中，用于能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系的其他组分和装置 是本领域已知的用于能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系的其他组分和装置，如用于LAMP 的其他组分和装置。
[0034] 本发明的上述检测方法很容易应用于现场护理和现场核酸检测，其具有所有的理 想特征：
[0035] ?简单温度控制（一次性暖包即可满足实验条件）。
[0036] ?用肉眼即可对结果进行判断和解释。
[0037] ?易于试剂运输和储存（用于LAMP的冻干试剂）和高鲁棒性（用于LAMP的部分 处理或未经处理的样品）。
[0038] ?无携带污染的隐忧。
[0039] ?高灵敏度（在所有报道的基于AuNP的比色核酸检测平台中最灵敏）。
[0040] ?低成本（MUA相对于巯基修饰的寡核苷酸便宜）。
【附图说明】
[0041] 图1、通过镁离子（Mg2+)