一种动物经济性状线粒体基因效应的分析方法

文档序号:8554597阅读:305来源:国知局
一种动物经济性状线粒体基因效应的分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物经济性状技术领域,尤其涉及一种动物经济性状线粒体基因效应 的分析方法。
【背景技术】
[0002] 线粒体是动物细胞的动力工厂,机体内90%以上的能量都是由线粒体供给。线粒 体DNA(mitochondrial DNA,以下简称mtDNA)是动物体内唯一长期、稳定存在的核外基因 组。在人类疾病中,目前已发现上百种疾病与mtDNA多态有关,mtDNA多态导致呼吸链复 合体氧化磷酸化缺陷进而引发线粒体功能缺陷成为诱发众多疾病的起因。除疾病以外,运 动耐力、脂肪沉积、寿命等性状都与mtDNA类型密切相关。在农业动物经济性状方面,目前 已在牛、羊、猪、鸡、鸭等畜禽的研宄中陆续报道了 mtDNA基因效应,例如奶牛的产奶量、乳 脂量、体细胞数性状,肉牛的生长与肉质性状,鸡的抗马立克病性状,鸭的屠体性状,猪的21 日龄断奶体重、日增重性状,绵羊的产仔数性状等。
[0003] 尽管利用mtDNA多态位点或线粒体基因组单倍型进行线粒体基因效应分析方法 在不同物种、不同经济性状上已有报道,但这些方法都不是从线粒体基因组的角度系统地 分析线粒体基因效应。只是通过单个或几个mtDNA多态位点的方法,没有考虑全部线粒体 基因组多态位点的效应;而以线粒体基因组单倍型的分析方法没有考虑每个多态位点效应 以及多态位点间的互作效应。目前,检测线粒体基因组单倍型的方法是利用线粒体基因组 覆盖引物的PCR测序技术,即对所有样品(个体)逐一进行线粒体基因组分段引物的PCR 扩增及PCR产物的测序,该方法费时、费力,需要大量的PCR扩增和PCR产物测序的重复操 作。

【发明内容】

[0004] 本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术之不足,提供一种动物经济性 状线粒体基因效应的分析方法,其建立了线粒体基因组单倍型快速、简便的检测方法,节省 了现行方法中对每个实验样品进行PCR扩增测序的重复操作,提高了实验检测效率,降低 了实验费用。
[0005] 本发明提供的一种动物经济性状线粒体基因效应的分析方法采用的主要技术方 案为:包括如下步骤:
[0006] (1)将提取的动物资源群的DNA样品等量混合作为DNA模板,然后使用覆盖线粒体 基因组的特异引物进行PCR扩增、测序,获得动物资源群线粒体基因组多态信息;
[0007] (2)针对动物资源群线粒体基因组多态信息,采用AS-PCR方法对每个多态位点进 行基因型鉴定,获得资源群个体的线粒体基因组单倍型;
[0008] (3)通过动物模型分别分析各多态位点基因型和单倍型与经济性状的关联性,获 得多态位点和单倍型的遗传效应;
[0009] (4)通过对存在显著遗传效应的多态位点所构成的合并基因型与经济性状的关联 分析,获得多态位点间的互作效应。
[0010] 本发明提供的一种动物经济性状线粒体基因效应的分析方法,采用如下附属技术 方案:
[0011] 所述步骤1中对动物资源群的线粒体基因组特异覆盖引物进行扩增的方法为设 计物种特异的16对覆盖线粒体基因组的PCR引物,每段扩增片段长度I. 2kb,相邻片段有 IOObp的重叠区域,各段PCR片段扩增程序按照常规方法进行。
[0012] 所述步骤1中对动物资源群的线粒体基因组特异覆盖引物进行测序的方法为采 用PCR产物直接测序的方法。
[0013] 所述步骤2中对个体多态位点的基因型鉴定的方法为等位基因特异引物PCR方 法。
[0014] 所述等位基因特异引物PCR方法为利用Taq DNA聚合酶缺少:V -5'外切核酸酶 活性的特点,在一定条件下PCR引物3'末端的错配导致扩增产物的急剧减少,从而针对不 同的已知突变设计适当的引物,通过PCR方法直接达到区分突变型与野生型基因的目的。
[0015] 所述步骤3中多态位点和单倍型遗传效应的分析方法采用的动物模型为SAS9. 0 统计分析软件广义线性模型中的LSM过程,模型包括多态位点或单倍型效应、父系效应、年 季效应和环境误差。
[0016] 所述步骤中4分析多态位点间互作效应的方法为通过分析合并基因型与经济性 状的关联性获得多态位点间的互作效应。
[0017] 所述合并基因型是指根据所述等位基因特异引物PCR方法获得的存在显著遗传 效应的多态位点所构成的基因型。
[0018] 所述合并基因型的基因效应采用动物模型为SAS9. 0统计分析软件广义线性模型 进行分析。
[0019] 步骤1中提取动物资源群DNA的方法,包括以下步骤:
[0020] a、向200 μ L动物资源群的抗凝血中加入500ul悬浮液,混匀后,再加入蛋白酶K, 使蛋白酶K的浓度为100ng/mL,在55°C的温度下孵育4h ;
[0021] b、向上述溶液中依次加入等体积的Tris-饱和苯酷、体积比为24 : 1的氯仿和异 戊醇,抽提2次;
[0022] c、取一定量的液相,向其加入1/10体积3M的醋酸钠溶液和2. 5倍体积的无水乙 醇,在-20°C下,静置30min,然后在12000g条件下,离心10min,沉淀干燥后用适量超纯水溶 解备用。
[0023] 所述悬浮液包括1 %的十二烷基硫酸钠、400mmol氯化钠、5mmol的EDTA和20mmol 的Tris-cl溶液。
[0024] 所述 Tris-cl 溶液的 pH 为 8. 0。
[0025] 本发明的动物经济性状线粒体基因效应的分析方法的有益效果在于:
[0026] 1)本发明采用DNA混池测序结合等位基因特异PCR技术(AS-PCR)替代现有技术 方法中对每个实验样品(个体)的PCR扩增测序,有针对性地检测每个多态位点的基因型, 节省了现行方法中对每个实验样品进行PCR扩增测序的重复操作,提高了实验检测效率, 降低了实验费用,建立了线粒体基因组单倍型快速、简便的检测方法。
[0027] 2)本发明既包括了线粒体基因组单倍型效应和每个多态位点的基因效应,还包 括单个多态位点间的互作效应,提供了一种全新的动物经济性状线粒体基因效应的分析方 法,能够系统地分析动物经济性状的线粒体基因效应。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
[0029] 本发明的动物经济性状线粒体基因效应的分析方法包括如下步骤:
[0030] 一、本实施例选用实验动物为猪资源群,其中,母猪113头,产仔数记录为365个。
[0031] 猪资源群DNA的提取方法:向200 μ L动物资源群的抗凝血中加入500ul悬浮液, 混匀后,再加入蛋白酶K,使蛋白酶K的浓度为100ng/mL,在55°C的温度下孵育4h ;然后向 上述溶液中依次加入等体积的Tris-饱和苯酚、体积比为24 : 1的氯仿和异戊醇,抽提2 次;最后,取一定量的液相,向其加入1/10体积3M的醋酸钠溶液和2. 5倍体积的无水乙醇, 在-20°C下,静置30min,然后在12000g条件下,离心10min,沉淀干燥后用适量超纯水溶解 备用。
[0032] 二、猪资源群DNA等量混池并进行扩增和测序
[0033] 测定每个DNA样品的浓度,按照每个DNA样品浓度为IOOng/ μ L组成DNA混池(混 合DNA样品数量最多为20个),本实施例建立6个DNA池;利用16对线粒体基因组特异PCR 引物(引物信息见表1)分别对DNA混池进行扩增和测序,共检测到猪资源群线粒体基因组 9个多态位点(见表2)。
[0034] 表1猪线粒体基因组特异PCR引物信息
【主权项】
1. 一种动物经济性状线粒体基因效应的分析方法,其特征在于,包括如下步骤: (1) 将提取的动物资源群的DNA样品等量混合作为DNA模板,然后使用覆盖线粒体基因 组的特异引物进行PCR扩增、测序,获得动物资源群线粒体基因组多态信息; (2) 针对动物资源群线粒体基因组多态信息,采用AS-PCR方法对每个多态位点进行基 因型鉴定,获得资源群个体的线粒体基因组单倍型; (3) 通过动物模型分别分析各多态位点基因型和单倍型与经济性状的关联性,获得多 态位点和单倍型的遗传效应; (4) 通过对存在显著遗传效应的多态位点所构成的合并基因型与经济性状的关联分 析,获得多态位点间的互作效应。
2. 根据权利要求1所述的动物经济性状线粒体基因效应的分析方法,其特征在于:所 述步骤1中对动物资源群的线粒体基因组特异覆盖引物进行扩增的方法为设计物种特异 的16对覆盖线粒体基因组的PCR引物,每段扩增片段长度I. 2kb,相邻片段有IOObp的重叠 区域,各段PCR片段扩增程序按照常规方法进行。
3. 根据权利要求1所述的动物经济性状线粒体基因效应的分析方法,其特征在于:所 述步骤1中对动物资源群的线粒体基因组特异覆盖引物进行测序的方法为采用PCR产物直 接测序的方法。
4. 根据权利要求1所述的动物经济性状线粒体基因效应的分析方法,其特征在于:所 述步骤2中对个体多态位点的基因型鉴定的方法为等位基因特异引物PCR方法。
5. 根据权利要求4所述的动物经济性状线粒体基因效应的分析方法,其特征在于:所 述等位基因特异引物PCR方法为利用Taq DNA聚合酶缺少3' -5'外切核酸酶活性的特 点,在一定条件下PCR引物3'末端的错配导致扩增产物的急剧减少,从而针对不同的已知 突变设计适当的引物,通过PCR方法直接达到鉴定基因型的目的。
6. 根据权利要求5所述动物经济性状线粒体基因效应的分析方法,其特征在于,步骤3 多态位点和单倍型遗传效应的分析方法采用的动物模型为SAS9. 0统计分析软件广义线性 模型中的LSM过程,模型包括多态位点或单倍型效应、父系效应、年季效应和环境误差。
7. 根据权利要求6所述的动物经济性状线粒体基因效应的分析方法,其特征在于:步 骤4分析多态位点间互作效应的方法为通过分析合并基因型与经济性状的关联性获得多 态位点间的互作效应。
8. 根据权利要求7所述的动物经济性状线粒体基因效应的分析方法,其特征在于:所 述合并基因型是指根据所述等位基因特异引物PCR方法获得的存在显著遗传效应的多态 位点所构成的基因型。
9. 根据权利要求8所述的动物经济性状线粒体基因效应的分析方法,其特征在于:所 述合并基因型的基因效应采用动物模型为SAS9. 0统计分析软件广义线性模型进行分析。
【专利摘要】本发明涉及动物经济性状分析的技术领域,尤其涉及一种动物经济性状线粒体基因效应的分析方法,包括线粒体基因组单倍型效应、单个多态位点的基因效应以及单个多态位点间的互作效应。本发明采用DNA混池测序结合等位基因特异PCR技术(AS-PCR)替代现有技术方法中对每个实验样品(个体)的PCR扩增测序,有针对性地检测每个多态位点的基因型,节省了现行方法中对每个实验样品进行PCR扩增测序的重复操作,提高了实验检测效率,降低了实验费用,建立了线粒体基因组单倍型快速、简便的检测方法。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104878110
【申请号】CN201510319391
【发明人】赵兴波
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月11日
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